復發膠質瘤組織中miRNA-200c的表達 及作用機制研究

恒聰 李鎮宇 鄧敏峰 曹志愷

【摘要】 目的：探討各級別及復發膠質瘤中miRNA-200c（miR-200c）的表達及可能機制。方法：收集本院收治的43例膠質瘤手術患者腫瘤切除標本，按照組織學分級不同將43例膠質瘤手術患者分為低級別膠質瘤組15例、高級別膠質瘤組22例、復發膠質瘤組6例，另選取10例正常腦組織標本為對照組。使用RT-PCR檢測各級別初發膠質瘤及復發膠質瘤患者腫瘤組織中miR-200c的表達水平，通過Western blotting檢測腫瘤干性指標（CD133、Nestin）及上皮間充質轉化（EMT）標志物（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）在各組織中的表達。結果：各組miR-200c表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）;各組Nestin表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸升高，E-cadherin表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）;高級別膠質瘤組、復發膠質瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質瘤組顯著升高（P<0.05）;高級別膠質瘤組、復發膠質瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高（P<0.05），且復發膠質瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質瘤組、高級別膠質瘤組顯著升高（P<0.05）。結論：miR-200c在復發及高級別膠質瘤中表達下降，其缺失可能誘導EMT使腫瘤干性增加，可作為高級別及復發膠質瘤治療的潛在靶點。

【關鍵詞】 miR-200c 復發膠質瘤 上皮間充質轉化 膠質瘤腫瘤干細胞

[Abstract] Objective： To investigate the expression and possible mechanism of miRNA-200c （miR-200c） in different grades of glioma and recurrent glioma. Method： The tumor resection specimens of 43 patients with glioma were collected， according to the histological classification， 43 patients were divided into low-grade glioma group （15 cases）， high-grade glioma group （22 cases） and recurrent glioma group （6 cases）， another 10 normal brain tissues were selected as the control group. RT-PCR was used to detect the expression of miR-200c in primary and recurrent glioma， Western blotting was used to detect the expression of tumor dryness index （CD133， Nestin） and epithelial mesenchymal transition （EMT） markers （E-cadherin， N-cadherin， Vimentin） in various tissues. Result： The miR-200c expression level of each group decreased with the increase of glioma grade， the differences between the two groups were statistically significant （P<0.05）. The Nestin expression level of each group increased with the increase of glioma grade， the E-cadherin expression level of each group decreased with the increase of glioma grade， the differences between the two groups were statistically significant （P<0.05）. The expression level of CD133 in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in control group and low-grade glioma group （P<0.05）. The expression levels of N-cadherin and Vimentin in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）， and the expression levels of N-cadherin and Vimentin in the recurrent glioma group were significantly higher than those in the low-grade glioma group and the high-grade glioma group （P<0.05）. Conclusion： The expression of miR-200c decreased in recurrent and high-grade glioma， and the absence of miR-200c may induce EMT to increase tumor dryness， which may be a potential target for the treatment of high-grade and recurrent glioma.

神經膠質瘤是成人中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，具有發病率、致死率高的特點，其中高級別膠質瘤患者的平均生存期僅為12～15個月[1-2]。目前膠質瘤復發的機制仍不明確，有學者認為目前的常規治療并未能有效地清除膠質瘤腫瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs），所以復發也就在所難免[3]。有研究證實，腫瘤干細胞和上皮細胞間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）之間有密切聯系[4-5]，而MicroRNA（miR）-200c是調節腫瘤干細胞及腫瘤細胞EMT過程的重要分子[6]。盡管miR-200c在各類腫瘤中均有不同程度的改變，其是否參與膠質瘤的復發仍需要進一步探討。該研究采用RT-PCR方法檢測miR-200c在各級別及復發膠質瘤中的表達情況，并通過Western blotting分析EMT相關分子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）及腫瘤干性相關分子（NESTIN、CD133）在各組織樣本中表達情況，探討miR-200c在復發膠質瘤發放發展中的作用，為復發膠質瘤的診治提供前期基礎?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源及分組 收集2017年1月-2019年12月本院收治的43例膠質瘤手術患者腫瘤切除標本，男28例、女15例;年齡<50歲24例、年齡≥50歲19例;腫瘤直徑<5 cm 16例、腫瘤直徑≥5 cm 27例;根據WHO 2007年中樞神經系統腫瘤分類標準進行組織學分級：初發患者中Ⅰ級7例、Ⅱ級8例、Ⅲ級13例、Ⅳ級9例，復發膠質瘤為二次及多次手術患者6例（病理均為WHO Ⅳ級）。納入標準：所有初發患者術前均未進行放化療;所有患者術后均行同步放化療（同步放化療采用直線加速器放療，根據頭顱MRI定位，采用局部擴大放療，總劑量60 Gy，分30次，共6周），口服替莫唑胺75 ms/（m2·d），共42 d。排除標準：復發膠質瘤術后未進行放化療及術后病理分級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的不納入組。另選取同期10例正常腦組織標本為對照組，均取自同期因顱腦損傷或腦出血需行內減壓術的患者，術后病理檢查證實均為正常腦組織。按照組織學分級不同將43例膠質瘤手術患者分為低級別膠質瘤組（WHO-Ⅰ/Ⅱ級）15例、高級別膠質瘤組（WHO-Ⅲ/Ⅳ級）22例、復發膠質瘤組（WHO-Ⅳ級）6例。該研究獲得廣州市第一人民醫院倫理委員會同意及患者家屬簽字認可，操作符合臨床試驗倫理規范。

1.2 RT-PCR法檢測各組miR-200c 常規Trizol試劑抽提總RNA，無酶水溶解沉淀。紫外分光光度計測定RNA提取液的A260及A280吸光度值，檢測RNA純度和濃度。逆轉錄反應按轉錄miRNA逆轉錄試劑盒（上海吉瑪生物技術有限公司）說明書進行。反應體系：5×RT緩沖液4 μL、1 μmol/L miRNA特異性RT引物1.2 μL、25 mmol/L鎂離子3 μL、10 mmol/L dNTP 0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL、200 U/μL MMLV逆轉錄酶0.2 μL、RNA 1 μg，用無酶水補至20 μL。反應條件：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。采用SYBR方法，應用Biorad公司的定量PCR儀IQ5進行定量PCR反應，U6作為內對照。反應體系：2×PCR緩沖液10 μL、5 μmol/L miRNA特異性PCR引物0.4 μL、RT產物1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、無酶水加至20 μL。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s、62 ℃ 40 s，共40個循環。

miR-200c的相對表達量通過公式2-△Ct計算，其中，△Ct=miR-200c平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3 Western blotting檢測各組相關分子表達情

況 裂解液冰上裂解各組組織提取總蛋白，測定蛋白濃度，每孔上樣量為40 μg。按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明配置10%分離膠，電泳液，140 V電壓電泳1.5 h。按分子量切取相應目的條帶，280 MA濕轉80 min。封閉液（用1×TBST稀釋的5% BSA）封閉1 h。加入兔抗人Nestin（1︰1 000）、CD133（1︰1 000）、E-cadherin（1︰1 000）、N-cadherin（1︰1 000），鼠抗人Vimentin（1︰100）、β-Actin一抗（1︰500），雜交袋4 ℃孵育過夜。1×TBST洗膜3次，5 min/次。加入山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1︰10 000），室溫孵育1 h。1×TBST洗膜3次，5 min/次。ECL化學發光法曝光顯影。以image J分析條帶的灰度值。所需抗體均采購自Abcam公司。

1.4 統計學處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗或Dunnetts T3檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料比較 各組一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 各組miR-200c表達比較 檢測結果顯示，對照組、低級別膠質瘤組、高級別膠質瘤組、復發膠質瘤組miR-200c表達水平分別為（12.327±1.737）、（7.998±0.978）、（1.720±0.315）、（1.279±0.301），組間比較差異有統計學意義（F=371.890，P=0.000），且各組miR-200c表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.3 各組腫瘤干性指標表達比較 Werstern blotting法檢測結果顯示，各組間CD133、Nestin表達水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;其中高級別膠質瘤組、復發膠質瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質瘤組顯著升高，且復發膠質瘤組CD133表達水平較高級別膠質瘤組顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）;各組Nestin表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸升高，兩兩組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2、圖2。

2.4 各組EMT相關分子表達比較 各組N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表達水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;其中高級別膠質瘤組、復發膠質瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高（P<0.05），且復發膠質瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質瘤組、高級別膠質瘤組顯著升高（P<0.05）;各組E-cadherin表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3、圖3。

3 討論

膠質瘤是成人常見的顱內腫瘤，其中惡性程度高的膠質瘤侵襲性強，手術難以完全切除，術后復發率高，預后差[7]。而手術后放、化療等序貫治療還是難以避免膠質瘤的復發，這和腫瘤干細胞的存在有一定的關系。腫瘤干細胞學說認為腫瘤組織或者腫瘤轉移灶中存在極少且具有無限自我更新能力并可導致腫瘤發生的細胞-腫瘤干細胞樣細胞（cancer stem like cells，CSLCs）[8]。這類細胞具有成體干細胞的某些功能特征，包括自我增殖和多向分化的能力，稱為“干性（stemness）”[9]。研究發現，腫瘤干細胞在放化療抵抗和腫瘤復發過程中起關鍵作用[10]，而目前的常規治療可能并未能有效地清除這些細胞，所以復發也就在所難免[3]。因此深入探討腫瘤干性與復發膠質瘤的分子機制尤為重要。

miR為在真核細胞生物體中廣泛存在的非編碼小分子單鏈RNA，可以參與調控膠質瘤的發生發展，并在其侵襲和轉移過程中起促進或抑制作用。因此通過檢測各級別膠質瘤組織中miR表達情況，可對其預后的判斷提供重要依據。有研究表明miR-200家族成員（miR-200s）在晚期癌癥中經常被沉默。在膠質瘤中同樣可見miR-200b的低表達[11]。文獻[12]報道，miR-200c在人乳腺腫瘤干細胞及非致瘤癌細胞中存在差異性表達，可通過調節干細胞因子BMI1，抑制正常乳腺干細胞分化為乳腺小管，也可以抑制乳腺癌干細胞的成瘤能力。miR-200c下調在乳腺癌細胞中表達腫瘤干細胞標志物，重新表達miR-200可逆轉腫瘤標志物的特點[13]。腫瘤標志物表型的主要特點（無黏附力和增加細胞活力的能力）在目前的研究中都被確定為miR-200c的直接調控[14]。本研究結果顯示，各組miR-200c表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸降低，兩組間比較差異均有統計學意義（P<0.05），提示miR-200c在正常腦組織中的表達情況明顯高于膠質瘤組織，且miR-200c的表達情況與膠質瘤的級別呈負相關趨勢，特別是在復發膠質瘤中其表達經常被沉默。說明了在生長活躍、惡性程度高的膠質瘤中miR-200c水平明顯下降。

另一方面，miR不僅能參與調控膠質瘤的發生發展，并對正常胚胎干細胞的自我更新能力以及細胞分化能力起著重要的調節作用。目前越來越多的研究表明，EMT參與腫瘤的侵襲及遷移并與腫瘤細胞的干細胞特征密切相關。EMT通過改變腫瘤的微環境使腫瘤細胞獲得干細胞特性[15-18]，并在腫瘤轉移、治療抵抗和再復發中起關鍵作用[4-5]。同樣miR-200家族成員（miR-200s）亦參與了EMT過程。miR-200抑制EMT，上皮細胞獲得遷移、侵襲和間質細胞抗凋亡的能力。筆者研究了miR-200c是否調節通過調節EMT過程從而通過影響腫瘤干性調控膠質瘤的發生發展及復發。研究發現，在EMT的過程中伴隨著上皮標記分子E-cadherin的下調和間充質標記分子N-cadherin的上調。本研究檢測EMT相關分子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）及腫瘤干性相關分子（NESTIN、CD133）在各組織樣本中表達情況，結果顯示，高級別膠質瘤組、復發膠質瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質瘤組顯著升高，且復發膠質瘤組CD133表達水平較高級別膠質瘤組顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）;各組Nestin表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸升高，E-cadherin表達水平隨著膠質瘤級別升高逐漸降低，兩兩組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）;高級別膠質瘤組、復發膠質瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高（P<0.05），且復發膠質瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質瘤組、高級別膠質瘤組顯著升高（P<0.05）。上述結果與EMT的發生發展過程相關一致，且與本研究中腫瘤干性指標及miR-200c表達趨勢相一致，且Siebzehnrubl等[19]指出在膠質瘤和正常腦組織中可出現N-cadherin的明顯升高。上述結果提示，復發及高級別膠質瘤Vimentin表達明顯增高、E-cadherin表達明顯減少，的確有EMT的發生;但在低級別膠質瘤中，相比正常組織，EMT標記分子變化不明顯，表明在低級別膠質瘤中EMT不是其侵襲、遷移的主要特征。

綜上所述，復發及高級別膠質瘤比起正常組織及低級別膠質瘤，腫瘤細胞干性明顯增強，并有明確的EMT發生，且miR-200c表達水平也同各分子表達呈線性相關趨勢。證實了miR-200c參與調控了復發及惡性膠質瘤EMT發生，并調控了其腫瘤細胞的干性，這三者緊密聯系，可能是膠質瘤復發的重要原因之一。miR-200c一方面可以調控EMT發生，另一方面調控腫瘤細胞的干性，可以認為是EMT和腫瘤干細胞的樞紐調控分子。但對于其中調控的分子機制仍有待進一步的研究，從而尋找一條治療膠質瘤的新道路。

參考文獻

[1] Weller M，Van Den Bent M，Tonn J C，et al.European Association for Neuro-Oncology（EANO） guideline on the diagnosis and treatment of adult astrocytic and oligodendroglial gliomas[J].Lancet Oncol，2017，18（6）：e315-e329.

[2] Omum A，DeAngelis L M.Glioblastoma and other malignant gliomas：a clinical review[J].JAMA，2013，310（17）：1842-1850.

[3] Blanco E，Shen H，Ferrari M.Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery[J].Nat Biotechnol，2015，33（9）：941-951.

[4] Zhang Y，Weinberg R A.Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer：complexity and opportunities[J].Front Med，2018，12（4）：361-373.

[5] Ouanouki A，Lamy S，Annabi B.Periostin，a signal transduction intermediate in TGF-β-induced EMT in U-87MG human glioblastoma cells，and its inhibition by anthocyanidins[J].Oncotarget，2018，9（31）：22023-22037.

[6] Krebs A M，Mitschke J，Lasierra Losada M，et al.The EMT-activator Zeb1 is a key factor for cell plasticity and promotes metastasis in pancreatic cancer[J].Nat Cell Biol，2017，19（5）：518-529.

[7] Ponnampalam S N，Kamaluddin N R，Zakaria Z，et al.A blood-based gene expression and signaling pathway analysis to differentiate between high and low grade gliomas[J].Oncol Rep，2017，37（1）：10-22.

[8] Brooks M D，Burness M L，Wicha M S.Therapeutic implications of cellular heterogeneity and plasticity in breast cancer[J].Cell Stem Cell，2015，17（3）：260-271.

[9] Ciardiello C，Leone A，Budillon A.The crosstalk between cancer stem cells and microenvironment is critical for solid tumor progression：The significant contribution of extracellular vesicles[J].Stem Cells Int，2018，2018：6392198.

[10] Hale J S，Sinyuk M，Rich J N，et al.Decoding the cancer stem cell hypothesis in glioblastoma[J].CNS Oncol，2013，2（4）：319-330.

[11] Guo E，Wang Z，Wang S.MiR-200c and miR-141 inhibit ZEB1 synergistically and suppress glioma cell growth and migration[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（16）：3385-3391.

[12] Nieto M A，Huang R Y J，Jackson R A，et al.EMT：2016[J].Cell，2016，166（1）：21-45.

[13] Michalak E M，Burr M L，Bannister A J，et al.The roles of DNA，RNA and histone methylation in ageing and cancer[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2019，20（1）：573-589.

[14] Humphries B，Yang C.The microRNA-200 family：small molecules with novel roles in cancer development，progression and therapy[J].Oncotarget，2015，6（9）：6472-6498.

[15] Fischer K R，Durrans A，Lee S，et al.Epithelial-to-mesenchymal transition is not required for lung metastasis but contributes to chemoresistance[J].Nature，2015，527（7579）：472-476.

[16] Shibue T，Weinberg R A.EMT，CSCs，and drug resistance：the mechanistic link and clinical implications[J].Nat Rev Clin Oncol，2017，14（10）611-629.

[17] Ahmed N，Abubaker K，Findlay J，et al.Epithelial mesenchymal transition and cancer stem cell-like phenotypes facilitate chemoresistance in recurrent ovarian cancer[J].Curt Cancer Drug Targets，2010，10（3）：268-278.

[18] Jiao F，Hu H，Han T，et al.Long noncoding RNA MALAT-1 enhances stem cell-like phenotypes in pancreatic cancer cells[J].Int J Mol Sci，2015，16（4）：6677-6693.

[19] Siebzehnrubl F A，Silver D J，Tugertimur B，et al.The ZEB1 pathway links glioblastoma initiation，invasion and chemoresistance[J].EMBO Mol Med，2013，5（8）：1196-1212.

（收稿日期：2020-03-05） （本文編輯：董悅）