豬皮膠原肽-鋅螯合物的制備工藝研究

吳家勁,邊智杰,朱悅,張學濤,龐荔丹,高鵬

(山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

豬皮為豬科動物的皮膚，可藥食兩用。在工業應用中，由于豬皮存在必需氨基酸的構成欠缺、人體條件下難消化、蛋白質生物效價低等缺點[1]，除一部分應用于皮革生產外,豬皮原料只有20%轉化為成品,其他大部分都變成了固體廢棄物,這極大地浪費了資源,并且嚴重污染環境[2]。豬皮蛋白質含量豐富，降解后形成的膠原多肽，不僅具有較高的消化吸收性，還有保護胃黏膜以及降血壓、抗潰瘍、提高骨骼強度、促進皮膚膠原代謝等生理功能[3]。

鋅是人體必需的微量元素之一，對人體健康狀況有重要的調控作用，被醫學和營養學界譽為“智能元素”[4]。鋅與小肽螯合形成的小肽螯合鋅具有特殊的單環螯合結構，與氨基酸螯合鋅相比，小肽螯合鋅更利于吸收，且穩定性更強，具有良好的補鋅、抗菌、抗氧化以及提高機體免疫力的效果[5-7]，極大提高了生物學效價。

目前肽-鋅螯合物的研究大多集中在水產動物蛋白與鋅的螯合物上，主要有牡蠣肽鋅螯合物[8]、羅非魚鱗膠原肽鋅螯合物[9]、克氏原螯蝦殼肽鋅螯合物[10]、細點圓趾蟹肉酶解肽鋅螯合物[11]、鰱魚蛋白小肽鋅螯合物[12]等，但是對豬皮膠原肽螯合鋅的研究較少。

本研究以豬皮為原料，采用響應面法對豬皮膠原肽(以下簡稱豬皮肽)和硫酸鋅的螯合工藝進行考察優化，旨在進行豬皮的深入開發研究，為今后的豬皮高值化加工利用提供理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 試驗儀器

PHB-4型pH計(上海雷磁儀器有限公司)；HH-2型數顯恒溫水浴鍋(上海力辰邦西儀器科技公司)；RE-52型旋轉蒸發器(上海亞榮科技有限公司)；FC5513型高速離心機(上海奧豪斯離心機有限公司)；JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海雷磁儀器有限公司)；HX-10型真空冷凍干燥機(上海圣科儀器有限公司)；UV-1780紫外可見分光光度計(日本島津儀器有限公司)。

1.2 試驗材料

新鮮豬皮(濟南金鑼肉食廠)；堿性蛋白酶(2000 U/mg)、菠蘿蛋白酶(2000 U/mg)(上海佛森生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(上海源葉生物科技有限公司)；其他試劑均為國產分析純。

2 試驗方法

2.1 豬皮肽的制備

豬皮肽的制備方法參照文獻[13]。

2.1.1 去雜

取新鮮豬皮，刮去皮下雜質，-10 ℃冷凍24 h,剪刀剪成碎塊(D≤2 mm、L≤1 cm)。

2.1.2 脫脂

取豬皮碎塊，加入5倍量(即豬皮碎塊質量的5倍)且質量分數為0.3%的氫氧化鈉溶液脫脂8 h，濾去堿液，水洗至近中性，得脫脂豬皮。

2.1.3 酶解

脫脂豬皮勻漿8 min，加8倍量水加熱煮沸15 min，冷卻至55 ℃，轉移至旋轉蒸發器，加入脫脂豬皮質量1%的堿性蛋白酶，55 ℃保溫酶解1 h，后加入1%菠蘿蛋白酶，55 ℃保溫酶解3 h，酶解液加熱煮沸15 min滅酶，過濾，濾液冷藏約12 h，離心，取上清液減壓濃縮，冷凍干燥后即得豬皮酶解原液凍干粉。

2.2 酶解原液凍干粉肽含量的測定

采用福林酚比色法[14],以牛血清白蛋白溶液為對照品，記錄對照品濃度和吸光度，數據進行線性回歸分析，計算凍干粉中的膠原肽質量分數。標準曲線為Y=16.883X+0.229 6(R2=0.993 8)，計算得豬皮肽的質量分數為66.92%。

2.3 螯合工藝

螯合工藝為：新鮮豬皮→豬皮酶解液→豬皮肽→測肽含量→調pH→加一定比例硫酸鋅→恒溫持續攪拌螯合→無水乙醇沉淀→離心→定溫減壓干燥→肽鋅螯合物。

2.4 豬皮肽-鋅螯合單因素試驗

2.5 豬皮肽-鋅螯合響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，使用Design-Expert.V8.0.6.1軟件,進行4因素3水平的響應面分析試驗，以螯合率為指標，考察豬皮肽-鋅質量比(x1)、螯合pH(x2)、螯合溫度(x3)、螯合時間(x4)對螯合工藝的影響。響應面試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼表Table 1 Response surface method factor level

2.6 螯合率的測定

采用乙二胺四乙酸(EDTA)絡合滴定法[15]。稱取一定量的豬皮肽螯合鋅粉末，置于100 mL燒杯中，加50 mL水和數滴6 mol/L的鹽酸，超聲至溶解完全,冷卻定容至100 mL，取10 mL于三角瓶，加入10 mL NH3-NH4Cl( pH=10)緩沖液，鉻黑T指示劑2～3滴，用0.02 mol/L Na2EDTA溶液滴定至由酒紅色變為藍色，記錄滴定消耗毫升數，每份樣品溶液平行測定3次，取平均值，計算鋅離子螯合率。

(1)

(2)

式中:M1為小肽螯合鋅中鋅離子的質量；c為EDTA標準溶液濃度，mol/L；V0為空白試驗消耗Na2EDTA的體積，mL；V1為測定時平均消耗Na2EDTA的體積，mL。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果分析

3.1.1 螯合溫度對螯合率的影響

由圖1可知，溫度升高，螯合率先增加后減??；0～50 ℃時，兩者呈正相關關系，最適溫度在50 ℃附近，此時螯合率最大；大于50 ℃，溫度升高，螯合率隨之減小，可能因溫度偏高，致使部分螯合物結構穩定性[16]變差，部分螯合物分解使螯合率有所下降，所以最佳螯合溫度為50 ℃。

圖1 螯合溫度對螯合率的影響Fig. 1 Effect of temperature on chelating rate

3.1.2 螯合時間對螯合率的影響

由圖2可知，隨著反應的進行，螯合率先迅速增大后趨于不變。在0～50 min范圍內，肽鋅反應物濃度和接觸面積都比較大，所以前期反應速度較快；但隨著反應物濃度的下降，反應逐漸接近飽和，所以反應后期螯合率趨于不再增加，說明50 min時螯合反應已基本完成。在螯合時間為50 min時，螯合率趨于平穩，可作為最佳螯合時間。

圖2 螯合時間對螯合率的影響Fig. 2 Effect of time on chelating rate

3.1.3 螯合pH對螯合率的影響

由圖3可知，pH增大，螯合率隨之先上升后下降。pH<7.0時，螯合率隨pH增大一直增加，在pH=7.0時，螯合率最大。當pH>7.0時，鋅離子會發生沉淀，導致游離的鋅離子減少，因此螯合率隨pH增大一直減小。由此可見，肽鋅螯合物的等電點可能在pH=7.0附近，此時酸堿對螯合物的影響較小[17]，所以最佳螯合pH為7.0。

圖3 螯合pH對螯合率的影響Fig. 3 Effect of pH on chelating rate

3.1.4 豬皮肽-鋅質量比對螯合率的影響

圖4 豬皮肽-鋅質量比對螯合率的影響Fig. 4 Effect of mass ratio of pigskin peptide and zinc on chelating rate

3.2 豬皮肽-鋅螯合工藝響應面優化試驗

3.2.1 響應面試驗結果與方差分析

根據 Box-Benhnken試驗設計原理，以肽鋅螯合率為響應指標，以螯合肽-鋅質量比(x1)、pH(x2)、溫度(x3)、時間(x4)為響應變量，進行響應面優化試驗，響應面組合試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 響應面組合設計試驗及結果Table 2 Design and result of response surface method combination

續表2

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Variance analysis results of regression model

注:P<0.05，表明差異顯著;P<0.01，表明差異極其顯著。

4個因素與指標螯合率之間的響應面回歸模型為：y=69.32+4.30x1-4.19x2+2.98x3+2.26x4-2.18x1x2+0.28x1x3+0.35x1x4+0.44x2x3-0.39x2x4+0.45x3x4-9.22x12-9.15x22-6.34x32-4.31x42。

由表3可知，模型P<0.000 1，表示該模型極顯著，失擬項P=0.073 1>0.05差異不顯著，回歸模型無失擬因素。模型R2=0.964 2，證明響應面回歸模型與實際試驗擬合度較高，模型預測值與試驗實際測量值相關性較好，各因素與響應值螯合率之間存在顯著的線性關系，可用于豬皮膠原肽-鋅螯合工藝的分析預測。各因素中一次項x1、x2、x3、x4均為顯著影響(P<0.05)，其中豬皮肽-鋅質量比和pH對螯合率的影響最為顯著，各因素對螯合率影響程度由大到小的順序為：豬皮肽-鋅質量比，pH，溫度，時間。二次項x12、x22為極顯著影響(P<0.000 1)，二次項x32、x42為顯著影響(P<0.05)，交互項x1x2、x1x3、x1x4、x2x3、x2x4、x3x4的交互作用對螯合率的影響不是很顯著。

3.2.2 響應面分析

圖5 各因素對螯合率影響的響應曲面Fig. 5 The response surface for the chelating rate affected by various factors

由圖5(d)可知,螯合pH與螯合溫度兩因素有較強的交互作用，螯合pH對螯合率的影響顯著。螯合pH對響應值的影響大于螯合溫度。隨著螯合pH和螯合溫度的增加，螯合率逐漸增大然后減小。這與肽-鋅螯合物的等電點和穩定性有關，pH大于或小于7.0都不利于豬皮膠原肽-鋅螯合物的生成。所以當螯合pH 7.0,螯合溫度50 ℃時，螯合率達到最大值。

由圖5(e)可知,螯合pH與螯合時間兩因素有一定的交互作用，螯合pH對螯合率的影響較顯著。螯合pH對響應值的影響大于螯合時間。隨著螯合pH和螯合時間的增加，螯合率逐漸增大然后減小，這與肽-鋅螯合物的等電點和螯合過程中水分的蒸發有關。當螯合pH 7.0,螯合時間50 min時，螯合率達到最大值

由圖5(f)可知,螯合溫度與螯合時間兩因素交互作用不顯著，對螯合率的影響作用較小。螯合溫度對響應值的影響大于螯合時間。隨著螯合溫度和螯合時間的增加，螯合率逐漸增大然后減小，這與肽-鋅螯合物的穩定性和螯合過程中水分的蒸發有關。當螯合溫度50 ℃,螯合時間50 min時，螯合率達到最大值。

綜合圖5(a～f)可知，豬皮肽-鋅質量比和螯合pH對螯合率的影響最為顯著，螯合時間和溫度對螯合率的影響相比較小，豬皮肽-鋅質量比和pH過高或過低都會導致螯合率降低，這與方差分析結果一致，表明模型顯著可行。

3.3 最佳螯合工藝驗證試驗

4 結論

致謝：本文在山東中醫藥大學創新訓練平臺上完成。感謝山東中醫藥大學的支持與幫助，感謝姜珊和王常噒的指導。