骨髓活檢塑膠包埋在以單純血小板減少為表現的骨髓增生異常綜合征診斷中的應用價值

葉成林，姚永華，陳 真，賈 麟

（1.上海市楊浦區市東醫院血液科，上海 200438；2.上海國際醫學中心腫瘤科，上海 201318）

血小板減少患者常以出血為表現，而其病因則以免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）為多見，但也有其他病因如骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome,MDS）等，ITP 與以單純血小板減少為表現的MDS 在臨床表現上常難以鑒別，需要進一步行骨髓形態學及骨髓病理檢查以明確。臨床上常用的石蠟包埋骨髓病理切片，由于其操作中需脫鈣等原因，細胞形態不易辨識，常不足以進行鑒別診斷。相比傳統的石蠟包埋切片，骨髓活檢乙二醇-甲基丙烯酸酯（glycol-methacrylate,GMA）塑膠包埋切片中的造血細胞形態明顯優于傳統切片，便于細胞形態學的辨識，尤其是GMA塑膠包埋過程控制在制冷體系下，使熱敏感抗原保留較佳。浦杰等[1]曾在52例血液病患者的骨髓活檢GMA 包埋切片中對14 種單克隆標志物的表達進行觀察，證明該技術既可保留良好的抗原性，也有助于觀察免疫組織化學（免疫組化）標志物相關的形態學細節。本研究通過骨髓活檢GMA 塑膠包埋技術結合巨核細胞免疫標記方法，從47例以單純血小板減少為表現的患者中診斷出8例MDS 患者，現報告如下。

資料與方法

一、資料

2014 年8 月至2018 年10 月期間，選取來我院門診就診及住院的47例臨床表現為單純血小板減少的患者，其中男性20例，女性27例，年齡為46～84歲，平均年齡為72歲。

二、方法

1.骨髓活檢GMA 塑膠包埋：參考《實用血液病骨髓病理學彩色圖譜》相關內容[2]，制備包埋劑甲液和乙液。取固定好的骨髓活檢組織塊，浸于起始濃度為70%并逐級遞增的乙醇中進行脫水；將脫水后的骨髓活檢組織塊用針頭挑入特制的聚乙烯模具中，用滴管吸取GMA 單體甲液裝滿模具，并放入4 ℃的冰箱中浸泡2 h；用帶8 號針頭的1 mL 注射器吸取乙液 （聚乙二醇和N-N 二甲基苯甲胺混合液），滴3 滴入模具中，用細玻璃棒迅速將甲、乙兩液攪勻，并將活檢塊擺正在模具底部中央，置于4 ℃冰箱內，放置60 min 待其自聚；取出制作好的塑膠包埋塊，切割成3～4 μm 厚的切片。

2.免疫組化染色：選擇CD41 單抗免疫標記染色以區分小微巨核等病態巨核細胞，選擇CD33 單抗標記未成熟前體細胞異常定位 （abnormal localization of immature precursors,ALIP）結構中的前體細胞，用堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶（alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase,APAAP） 方法染色，所用試劑盒購自美國DAKO 公司，操作步驟如下。將骨髓活檢組織切片從-20 ℃冰箱中取出后，在室溫下放置15～20 min，用磷酸緩沖鹽溶液洗片3 次，再加入馬血清封閉20 min，依次加入一抗（鼠抗人單克隆抗體）、二抗（羊抗鼠免疫球蛋白）、三抗（APAAP 酶標復合物），并分別于室溫下各孵化2 h、40 min 和40 min，最后滴加顯色液顯色20 min。

3.細胞遺傳學檢查：對骨髓活檢組織進行染色體核型分析及MDS 相關基因檢查。檢查均送至上海金域醫學檢驗有限公司進行，檢測過程均符合細胞遺傳學實驗技術標準操作規程。

4.MDS 的診斷和分型標準：MDS 的診斷和分型均依據WHO（2016）的MDS 分型標準，其中骨髓任何系病態造血以病態發育細胞＞10%為標準[3]。

結果

一、診斷結果

在47例患者中，8例患者經病理診斷診斷為MDS，占血小板減少總人數的17%，其中男性3例，女性5例，其余39例患者被診斷為ITP 或其他非血液系統疾病所致的血小板減少患者。8例MDS 患者中3例為MDS 伴單系病態造血（myelodysplastic syndrome-single lineage dysplasia，MDS-SLD），4例為MDS 伴多系病態造血（myelodysplastic syndrome with multilineage dysplasia，MDS-MLD），1例為5q-綜合征。3例患者在入院前已診斷或擬診為免疫性血小板減少性紫癜，但治療效果不佳。8例MDS 患者就診時的平均血小板計數為18×109/L [（9～30）×109/L]（見表1）。

二、骨髓活檢病理表現及免疫組化染色結果

骨髓病理檢查可見，粒系、紅系、巨核系和淋巴系細胞顯示良好，細胞形態清晰，5例患者表現為多系病態造血，3例患者表現為單系病態造血。6例MDS 患者的骨髓組織骨小梁間中心區可觀察到真性ALIP 結構（即5～6個以上的未成熟前體細胞集聚），未成熟細胞的核膜清晰，可見核仁（見圖1A），并可見骨小梁旁同期幼紅細胞簇，主質內可見大、小簇ALIP 結構，ALIP 結構中粒系前體細胞呈CD33 染色強陽性（見圖1B、1C）。

表1 患者基本情況及病態造血、細胞遺傳學檢測結果

8例MDS 患者均可觀察到巨核系病態造血，可見巨大巨核細胞（見圖1D），而免疫組化染色可見微巨核細胞（見圖1E），其數量超過巨核細胞總數的10%。2例患者的骨髓組織切片中可見網狀纖維（+）（見圖1F）。

三、細胞遺傳學檢測結果

8例MDS 患者中有3例染色體核型分析及基因檢查異常，可見t（1，21）、5q-、7q-等（見表1）。

討論

單純血小板減少的患者在臨床上很常見，而以血小板減少為主要表現的MDS 與ITP 的鑒別方法目前主要集中在血清血小板生成素、外周血網織血小板以及骨髓細胞高碘酸希夫染色結果三方面。關于血清血小板生成素的水平差異，文瑞婷等[4]研究了117例血小板減少癥患者后發現，MDS 組、ITP組與正常對照組比較，血清血小板生成素水平差異無統計學意義，可能需要在低增生MDS 及其他類型MDS 亞型間行分層研究。外周血網織血小板是骨髓釋放入血的含有少量粗面內質網及mRNA 的新鮮血小板，其數量反映了人體血小板的更新能力，ITP 患者發病時網織血小板減少。但研究發現，采用網織血小板計數鑒別MDS 與ITP 的作用有限[5]。MDS 患者有核紅細胞陽性率較高，提示紅系存在病態造血，骨髓細胞高碘酸希夫染色陽性者的骨髓巨核細胞總數及淋巴樣小巨核細胞數量及比例升高，但營養性貧血等其他病因患者亦可呈現類似表現[6]。因此，臨床需要尋找更好的方法對兩者進行鑒別。

圖1 骨髓活檢組織病理圖片

一、骨髓活檢GMA 塑膠包埋

骨髓穿刺細胞學檢查是血液病診斷的基本方法，而骨髓活檢組織檢查更容易發現骨髓的增生程度、基質細胞、纖維化、細胞定位等方面的信息，尤其對于MDS，病態造血是其診斷的核心所在，對其診斷的意義更大[7]，將二者結合可以提高血液病的診斷率，減少漏診及誤診[8]。脫鈣的石蠟切片中細胞易皺縮，結構易被破壞，而GMA 塑膠包埋材料技術為不脫鈣包埋技術，包埋過程控制在低溫-低氧環境下進行，可有效防止熱損傷，熱敏感抗原保留較佳，這樣醫師不僅能觀察造血組織的結構、清晰地分辨造血細胞的各個階段[9],還能結合免疫標志物進一步辨別特異性的巨核系病態造血表現，可更精確地作出診斷。

二、巨核細胞免疫標記

有研究表明，在ITP 和MDS 患者中，巨核細胞的凋亡均呈現減少[10]，而巨核系病態造血，細胞多形性明顯，包括不產生血小板的巨大及雙核巨核細胞，極易與ITP 混淆。在病態造血的多種表現中，小微巨核細胞雖難以識別，但診斷特異度較高[11]。因此，正確識別巨核系病態造血是鑒別MDS 與ITP的關鍵。小巨核及微巨核細胞形態上難以被識別，產板是巨核細胞的特征，一定數量的小巨核細胞產板現象是巨核系病態造血的最重要特點，需要仔細觀察，避免疏漏。

通過免疫組化甚至涂片細胞化學染色的方法可以進一步標記巨核細胞。2010 年國際MDS 血液病理學工作會議建議，骨髓石蠟切片選擇1～2個巨核細胞標志 物，包 括CD42b、CD61 及CD31 及CD41，而本研究中采用的CD41 免疫標志物染色有助于識別小微巨核等病態巨核細胞，對巨核系病態造血的診斷有意義。

三、ALIP 結構鑒別

ALIP 結構也是支持MDS 診斷的重要依據，但需要注意部分低危MDS 中可見由紅系等前體細胞形成所謂“假性ALIP”結構，其多呈小簇分布（未成熟前體細胞一般不超過5～6個），而行免疫組化檢測可幫助鑒別，明顯的大簇ALIP 結構可見未成熟細胞集聚現象，有益于診斷MDS。本研究中圖1B和1C 亦證實了組成ALIP 結構的是CD33 陽性粒系前體細胞，為“真性”ALIP 結構。浦權等[2]使用CD33 來標記ALIP 結構中的前體細胞，本研究沿用此方法，主要考慮CD33 在髓系早期細胞表達，在造血干細胞和成熟細胞上均不表達，特異度相對較高。有研究認為，采用CD34 標記ALIP 結構中的前體細胞，其對MDS 的診斷意義更大[12]，但本研究考慮CD34 除在造血干和（或）祖細胞表達外，還可能在內皮細胞中表達，建議進一步行研究探索以驗證。

四、細胞遺傳學異常

特征性的細胞遺傳學異常是診斷MDS 的另一個重要依據。本研究診斷的8例MDS 患者中有3例檢出染色體異常，包括5q-及7q-，但有1例患者為t（1，21），意義不明，有待進一步研究。部分患者檢出有意義的細胞遺傳學異常（如5q-），但無病態造血證據，如符合診斷標準應診斷為ITP，但需密切隨訪，不排除意義未明的克隆性血細胞減少，警惕病情轉化可能[13]。

MDS 作為血液腫瘤性疾病，常伴隨不同程度的網狀纖維增生，而ITP 則極少出現纖維化，即使出現，程度也較輕[14]。因此，是否存在網狀纖維增生可作為二者鑒別的證據之一。

總之，采用骨髓活檢塑膠包埋及免疫組化技術，結合骨髓穿刺細胞形態學檢查及細胞遺傳學檢查，可以提高MDS 的診斷率。細胞形態學檢查結果提示巨核細胞病態造血，免疫組化檢測發現一定比例的小、微巨核細胞，組成主體為粒系前體細胞且呈大簇分布的ALIP 結構、網狀纖維增生，檢出MDS 常見的細胞遺傳學異常，以上均高度提示MDS。尤其對于單純血小板減少且常規ITP 治療方案無效的患者，應考慮MDS 的可能。但GMA 塑膠包埋及免疫組化技術相對石蠟包埋而言，對于技術層面的要求高，且不利于后續活檢組織的免疫組化染色，大規模普遍推廣受限，實用方面仍有很大的局限性，需要進一步探討及研究。