獼猴桃園生草對土壤微生物多樣性的影響

林峰 楊殿林 王華玲 王慧 劉紅梅 劉惠芬

摘要：探討生草對獼猴桃園土壤微生學特性的影響。采用Biolog生態板技術，研究自然留養雜草（CK）、黑麥草/白三葉復合種植（2種草）、黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉復合種植（4種草）、黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉/紫羊茅/毛苕子/波斯菊/百日草（8種草）4種生草處理模式對獼猴桃園土壤化學性質、土壤酶活性和土壤微生物群落功能多樣性的影響。結果表明，4種草處理能夠顯著提高土壤有機碳和全氮含量以及土壤堿性磷酸酶活性。培養96 h時，生態板的平均顏色變化率（AWCD）排序為4種草處理>8種草處理>2種草處理>CK。2種草處理的土壤微生物群落功能多樣性指數、優勢度指數和均勻度指數均低于對照，而4種草和8種草處理則均高于對照，但各處理間無顯著差異。主成分分析結果表明，4種生草處理模式下土壤微生物的碳源利用能力存在較大差異，4種草和8種草處理對土壤微生物碳源利用能力較高。

關鍵詞：獼猴桃園;生草;Biolog-Eco微平板;功能多樣性;土壤微生物

中圖分類號： S154.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0293-05

收稿日期：2019-05-21

基金項目：中國農業科學院丹江口水源涵養區綠色高效農業技術創新集成與示范項目（編號：CAAS-XTCX2016015）。

作者簡介：林 峰（1992—），男，安徽合肥人，碩士，研究方向為生物多樣性與生態農業。E-mail：1659200412@qq.com。

通信作者：劉紅梅，博士，副研究員，研究方向為生物多樣性與生態農業，E-mail：liuhongmei@caas.cn;劉惠芬，博士，教授，研究方向為飼草種質資源的評價與新品種選育，E-mail：paula913@126.com。

果園生草是近年來在國內興起的果園管理新模式[1]，該模式已在蘋果園、梨園、葡萄園等果園中得到應用。果園生草改變了過去人們對果園的傳統清耕管理方式，克服了傳統清耕方式導致的水土流失、地力退化和生物多樣性降低等一系列生態環境問題。有研究表明，生草能夠增加果園生物多樣性，提高土壤養分含量和酶活性[2-3]，增加細菌多樣性[4]，提高土壤微生物對碳源的利用能力[5]。果園生草是實現果樹產業提質增效及農業可持續發展的途徑之一。

土壤微生物是果園生態系統的重要組成部分，是土壤質量變化的重要指示指標。土壤酶參與土壤生物化學過程，是土壤微生物作用于生物化學過程的媒介，常用來表征土壤微生物的群落活性[6]。果園生草后，土壤微生物種群數量明顯提高，有利于改善果樹土壤根際微生物環境[7]。果園生草種植草的種類不同，對果園土壤微生學特性的影響效果也不同。龐建光等的研究表明，在桑園行間種植毛葉苕子能顯著提高土壤細菌、真菌和放線菌數量[8]?；葜烀返鹊难芯勘砻?，在葡萄園行間種植白三葉和紫花苜蓿對土壤肥力提高的效果優于種植高羊茅[9]。杜毅飛等的研究表明，種植白三葉和小冠花的土壤微生物活性高于種植雞腳草[5]。良好的土壤微生物學特性有助于果園生態系統的穩定，有利于果樹產量和品質的提高。

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）為多年生落葉藤本植物，是重要的經濟作物之一。生草栽培對獼猴桃園土壤養分、酶活性及微生物多樣性的影響尚不清楚。為此，本研究采用Biolog生態板法研究4種生草處理對獼猴桃園土壤理化性質、酶活性和微生物群落功能多樣性的影響，以期為獼猴桃園土地的合理化利用和科學管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗區位于湖北省十堰市農業科學院柳陂試驗基地獼猴桃果園，海拔高度為230 m，地理位置為 110°43′47″E、32°49′6″N，屬亞熱帶季風氣候。年平均氣溫為16 ℃，≥10 ℃有效積溫為5 139 ℃，無霜期224～225 d，生長期平均氣溫為22.6 ℃，年日照時數為 1 655～1 958 h，年降水量為800～900 mm，氣候溫和，日照充足。土壤為黃棕壤，偏堿性。

1.2 試驗設計與樣品采集

選擇試驗基地5年生獼猴桃園（行距3 m，株距5 m）進行生草試驗。于2018年3月進行播種。設4個生草處理：（1）自然留養雜草處理（對照，CK）;（2）黑麥草（Ryegrass）、白三葉（White clover）2種草復合種植;（3）黑麥草、白三葉、早熟禾（Poa pratensis）、紅三葉（Red clover）4種草復合種植;（4）黑麥草、白三葉、早熟禾、紅三葉、紫羊茅（Festuca rubra）、毛苕子（Vicia villosa）、波斯菊（Cosmos bipinnata）、百日草（Zinnia elegans Jacq）8種草復合種植。每個處理3次重復，小區面積為60 m×15 m，小區間設1.5 m隔離帶。

2018年7月采用“S”形取樣法進行土壤樣品的采集，每個小區選取10個點，去除表面植被后，用直徑為3 cm的土鉆，取0～20 cm土層的土壤樣品，將同一小區土壤樣品混合均勻，去除根系和土壤入侵物，然后采用四分法選取1 kg土樣并將其分成2份，將其中一份迅速裝入無菌封口袋，放入冰盒中帶回實驗室，存放于4 ℃低溫條件下，用于測定土壤微生物群落功能多樣性和速效養分含量;另一份土樣帶回室內，讓其自然風干，研磨過篩后用于土壤理化因子的測定。

1.3 測定方法

土壤pH值采用玻璃電極法（土水比1 ∶ 2.5）測定，土壤全氮含量采用凱氏定氮法測定，土壤銨態氮、硝態氮含量采用氯化鉀溶液提取-流動分析儀（AA3，德國）測定，土壤速效磷含量采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法測定，土壤有機碳含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定，上述測定方法參照鮑士旦主編的《土壤農化分析》[10]。

土壤酶活性采用酶試劑盒和分光光度計測定。

土壤微生物群落功能多樣性[11]的測定：稱取相當于10 g烘干土壤的新鮮土壤樣品，加入90 mL滅菌生理鹽水（濃度為0.85%），用封口膜將瓶口封好。在搖床上振蕩30 min后，搖勻，靜置10 min后，取上清用滅菌生理鹽水稀釋至 1 000 倍。將 150 μL 稀釋液加入到Biolog-Eco微平板的96個孔中，每個處理重復3次。將Biolog-Eco微平板放在生化培養箱中培養，28 ℃條件下連續培養7 d后，在Biolog微孔板讀數儀（BIOLOGInc.，USA）上每 24 h 讀數1次。Biolog數據采用Garland等提出的微平板每孔平均顏色變化率（AWCD）來表示[12]，AWCD具體計算公式如下：

AWCD=∑（Ci-R）/n。

式中：Ci為每個有培養基孔的光密度值;R為對照孔的光密度值;n為Biolog-Eco微平板上供試碳源的種類數，其值為31，重復3次。

用Shannon指數（H）、Simpson優勢度指數（D）和Shannon均勻度指數（E）來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性。采用培養96 h時Biolog-Eco平板孔的吸光值來計算土壤微生物群落功能多樣性指數，計算公式分別為

H=-∑pi×lnpi;

D=1-∑p2i;

E=H/lnS。

式中：Pi為第i孔相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率;S是有顏色變化的孔的數目。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2010軟件對數據進行統計分析，采用SPSS 16.0統計軟件進行單因素方差分析和主成分分析，采用最小顯著差數（One-way ANOVA）法進行差異顯著性檢驗，采用Duncans法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 生草栽培對土壤化學性質的影響

由表1可見，3種生草種植對土壤pH值、銨態氮含量和速效磷含量均無顯著性影響。種植8種草處理的土壤有機碳含量顯著高于CK、2種草處理和4種草處理（P<0.05），其中2種草、4種草處理的有機碳含量顯著高于對照處理（P<0.05），分別比對照提高34.98%和41.02%。種植4種草處理土壤全氮含量顯著高于自然留養雜草處理（CK）（P<0.05），比CK提高了21.57%;種植2種草和種植8種草的處理土壤全氮含量與對照無顯著差異。

2.2 生草栽培對獼猴桃園土壤酶活性的影響

生草栽培后土壤過氧化氫酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶活性變化見圖1。由圖1可見，2種草、4種草、8種草處理的土壤過氧化氫酶活性均高于CK，大小關系表現為4種草處理>2種草處理>8種草處理>CK，4種草、2種草、8種草處理較CK的增幅分別為6.78%、6.41%、5.57%，但各處理間無顯著差異。4種草、8種草處理可顯著提高堿性磷酸酶活性（P<0.05），2種草處理的堿性磷酸酶活性與CK相比無顯著差異，大小表現為8種草處理>4種草處理>2種草處理>CK，8種草、4種草、2種草處理較CK的增幅分別為23.10%、18.64%和1.30%。4種草處理和8種草處理的蔗糖酶活性高于CK，增幅分別為8.97%和6.63%，但無顯著差異;2種草處理顯著降低了蔗糖酶活性（P<0.05）。

2.3 不同生草栽培處理下微生物群落的平均顏色變化率變化特征

Biolog-Eco微平板每孔平均顏色變化率反映了土壤微生物利用單一碳源的能力，是土壤微生物活性及群落功能多樣性的重要指標[13]。由圖2可知，在培養24 h內，各生草栽培處理AWCD值均較小，說明在培養24 h內土壤微生物對碳源基本未利用。隨著培養時間的增加，不同生草處理的AWCD值均呈增長的趨勢，表明土壤微生物利用碳源的能力在不斷增加。AWCD值增長速率在不同種草處理下大不相同，說明不同處理間微生物對碳源的利用能力有較大差異。培養96 h后，AWCD值排序為4種草處理>8種草處理>2種草處理>CK。根據方差分析，4種草、8種草處理與CK之間具有顯著差異（P<0.05），2種草處理與CK之間無顯著差異。整體來看，培養期內土壤微生物的碳源利用能力在2種草、4種草、8種草處理下均高于CK。

2.4 生草栽培對土壤微生物群落多樣性指數的影響

不同種草處理下土壤微生物群落的功能多樣性指數見表2，可以看出，Shannon指數、均勻度指數、優勢度指數均在4種草處理下達到最大值。4種草、8種草處理的Shannon指數與CK相比分別提高 10.20% 和9.58%，但是各處理間均無顯著性差異;優勢度指數和均勻度指數值在4種草、8種草處理間相同，與CK相比均提高1.03%和1.80%。2種草處理的Shannon指數、優勢度指數、均勻度指數均低于CK?？傮w來說，4種草處理的土壤微生物群落多樣性優于其他2種生草處理。

2.5 土壤微生物群落碳源利用的主成分分析

利用培養96 h時的AWCD值，對4種草處理土壤微生物對31種碳源底物利用情況進行主成分分析。在31個因子中共提取3個主成分因子，累積方差貢獻率達到98.99%。選取累積方差貢獻率達到82.20%的前2個主成分PC1和PC2，分析微生物群落功能多樣性，其中第1主成分PC1貢獻率為5266%，第2主成分PC2貢獻率為29.54%。由圖3可見，不同生草處理的PC值在PC軸上出現了明顯的分布差異，整體可分為3類，4種草處理為一類，8種草處理為一類，2種草處理和自然留養雜草處理為一類，說明生草處理的不同明顯影響了土壤微生物對碳源的利用能力。在PC1軸上，4種草處理分布在正方向上，得分系數為1.75;8種草處理、2種草處理、CK分布在PC1軸負方向上，得分系數為-0.41～-0.65。在PC2軸上，8種草處理分布在正方向上，得分系數為1.63;4種草處理、2種草處理、CK分布在負方向上，得分系數為 -0.22～-0.99。說明4種草處理和8種草處理土壤微生物的碳源利用能力較高。

3 討論

果園生草增加了植物種類和根系分泌物，提高了生物量積累。已有研究表明，果園生草能增加土壤有機質含量[14]。本研究表明，黑麥草/白三葉復合種植、黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉復合種植和黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉/紫羊茅/毛苕子/波斯菊/百日草復合種植的土壤有機碳含量均顯著高于自然留養生草對照。李祥彬在蜜柚園生草后發現，土壤化學性質發生了顯著變化，其中，在0～60 cm土層，土壤有機質含量顯著提高[15]。周民生等的研究表明，獼猴桃園生草可以提高土壤有機質含量，且豆科牧草優于禾本科牧草，主要是由于種植豆科牧草可通過固氮作用提高土壤全氮含量[16]。本研究中黑麥草/白三葉復合種植與對照之間土壤全氮含量無顯著差異，黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉復合種植能顯著提高土壤有機碳、全氮含量。Qian等在蘋果園中種植白三葉和小冠花后，土壤全氮含量顯著提高，種植黑麥草與清耕處理之間無顯著差異[17]。

土壤酶活性反映土壤微生物活性和生化反應強度[18]。土壤蔗糖酶參與土壤碳循環轉化，其活性反映土壤碳轉化強度。過氧化氫酶分解土壤中產生的過氧化氫，反映生物呼吸強度。本研究表明，黑麥草/白三葉復合種植、黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉復合種植、黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉/紫羊茅/毛苕子/波斯菊/百日草復合種植均能提高土壤過氧化氫酶和堿性磷酸酶活性。徐凌飛等的研究表明，生草栽培提高了梨園土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性[19]。Qian等的研究表明，蘋果園生草提高了脲酶和堿性磷酸酶活性[17]。本研究與其研究結果一致，其主要原因是種植禾本科和豆科牧草，增加了土壤有機質含量，微生物可利用的營養物質增多，從而增加了土壤酶活性[20]。

土壤微生物多樣性是評價土壤生態系統穩定性的重要生物學指標[21-22]。本研究中，不同生草處理的AWCD值隨著培養時間的延長呈增加趨勢，即土壤微生物利用碳源代謝活性隨著培養時間的延長呈增加趨勢。在培養期內，黑麥草/白三葉復合種植、黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉復合種植和黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉/紫羊茅/毛苕子/波斯菊/百日草復合種植的AWCD值高于自然留養雜草對照，分析原因可能是生草栽培改善了土壤水熱狀況，提高了土壤養分含量，更有利于微生物的生存與繁殖。這與杜毅飛等在蘋果園生草的研究結果[5]一致。在培養96 h時，不同生草處理的土壤微生物碳源利用能力存在明顯差異，表現為4種草處理>8種草處理>2種草處理>CK。本研究主成分分析結果表明，4種生草處理在PC1和PC2軸明顯分開，說明4種生草處理土壤微生物的利用碳源能力不同。這是因為不同生草處理所產生的凋落物和根系分泌物數量和質量不同，凋落物和根系分泌物在分解過程中釋放的有機物質有很大差異，因此為微生物提供的營養物質不同。前人研究認為，不同植物根系產生的碳源類型不盡相同，從而導致土壤微生物群落組成不同[23]。本研究中，黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉復合種植和黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉/紫羊茅/毛苕子/波斯菊/百日草復合種植的Shannon指數、優勢度指數和均勻度指數均高于自然留養雜草對照，說明這2種生草處理模式的土壤微生物群落功能多樣性指數高于自然生草處理。

綜上可見，獼猴桃園生草栽培為果園土壤輸入了雜草凋落物和根系分泌物，改變了土壤理化性質，引起了土壤酶活性和土壤微生物群落組成發生變化。但由于本研究處理時間較短，只是初步反映了獼猴桃園生草栽培土壤微生物學性狀變化，因此，還需要進一步在較長時間范圍內觀測揭示獼猴桃園生草的土壤生態過程。

4 結論

本研究表明，獼猴桃園生草能夠改變土壤微生態環境，提高土壤過氧化酶和蔗糖酶活性。4種生草處理模式土壤微生物對碳源的利用差異很大，其中黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉復合種植土壤微生物對碳源的利用能力最高，其次是黑麥草/白三葉/早熟禾/紅三葉/紫羊茅/毛苕子/波斯菊/百日草復合種植。

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