NUCB2和Bcl-2在前列腺中的表達和相關性研究

劉歡 王麗強 單鏡源 羅振國

摘要：目的 檢測人前列腺組織中NUCB2和Bcl-2蛋白的表達，探索二者在前列腺癌中表達的意義和相關性。方法 收集選取本院2010年1月至2019年1月的前列腺組織標本，及病例臨床資料，應用免疫組化法檢測在良性前列腺增生（BPH）、前列腺上皮內瘤變（PIN）及前列腺癌（PC）組織中Nuxb2與Bcl-2的表達，并分析二者在PC組織中的表達有無相關性。結果 NUCB2在PC組織中的表達顯著高于BPH和PIN組織，其表達與年齡無關，與Gleason分級、術前血清PSA有關;<5年生存期病例的NUCB2表達陽性率高于>5年生存期病例。Bcl-2在PC組織中的表達顯著高于BPH和PIN組織，其表達與年齡無關，與Gleason分級及血清PSA均有關。在5年生存率上表達無差異。在前列腺癌組織中Nucb2與Bcl-2的表達呈正相關（P =0.012）。結論 NUCB2與Bcl-2兩者間可能存在一種相關性，聯合檢測二者有助于前列腺癌的進一步研究。NUCB2的檢測可能有助于評估前列腺癌的預后。

關鍵詞：前列腺癌;NUCB2 Bcl-2;免疫組化

【中圖分類號】R697? 【文獻標識碼】A??? 【文章編號】2107-2306（2020）02-018-03

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤之一，在中國，近年來前列腺癌的發病率一直在上升，也是導致男性因癌癥相關死亡的主要原因^[1]。盡管我們在前列腺癌的診斷和輔助治療方面取得了相當大的進步，但是迄今為止僅有低級別和局灶性前列腺癌治愈率達60%左右，中晚期患者5年生存率仍低于30%^[2-3]，患者整體生存率無明顯提高。因此對前列腺癌發生發展以及治療和預后的研究具有重要意義因此對前列腺癌發生發展以及治療和預后的研究具有重要意義。1992年，Kanai Y，Tanuma S^[4]等在小鼠及人細胞中發現了一種EF手型鈣結合蛋白，并將其命名為核組蛋白（ nucleobindin-2，NUCB2） 。目前發現NUCB2具有特殊的結構功能，并且是一種癌癥相關基因，該基因在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、腎透明細胞癌等中被相繼報道。BCL-2即B細胞淋巴瘤-2基因，抑制凋亡是目前研究的與凋亡關系十分密切的原癌基因之一，可抑制細胞凋亡延長其生長，導致腫瘤的發生^[4]。

1、材料與方法

1.1、標本來源及分組

收集佳木斯大學附屬第一醫院病理科2010年1月至2019年1月存檔前列腺石蠟標本，將病理組織分為三組，分別為前列腺癌組、前列腺上皮內瘤變組，以及前列腺良性增生組。其中前列腺癌51例、前列腺上皮內瘤變共39例[低級別上皮內瘤變（LGPIN）18例、高級別上皮內瘤變（HGPIN）21例]、良性前列腺增生20例。兩位資深病理醫師對所有標本進行嚴格審查。前列腺癌病例組患者年齡57-82歲，平均年齡 72歲，≥72歲者30例，<76歲者21例。通過查閱病例，搜集患者術前血清前列腺特異性抗原（PSA）水平。所有患者術前均無放化療..。前列腺癌組進行Gleason評分，對同一腫瘤的主要結構和次要結構分別評分，兩項評分相加總積分為≤5分者列為高分化組（4例）、6～7分者列為中分化組（19例）、8～10分者列為低分化組（22例）。對前列腺癌病例組進行隨訪，共40例患者滿足條件，其中5年內死亡25例，5年以上存活15例。

1.2、試劑

兔抗人 NUCB2多克隆抗體購自武漢優爾生，兔抗人Bcl-2單克隆抗體，SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑購自北京中杉金橋。

1.3、主要方法

標本按理想實驗要求切片;60℃烤箱烘烤1小時;二甲苯分梯度脫蠟;再用梯度酒精脫去二甲苯;PBS和蒸餾水沖洗;置于EDTA抗原修復液PH9.0高溫高壓抗原修復;切片至Tween 20，浸泡震蕩沖洗去污;切片至于3%的H2O2中滅活內源性酶及封閉內源性生物素，山羊血清抗原封閉;滴加配置好濃度的Nucb2一抗、滴加即用型Bcl-2一抗，常規孵育;滴加與一抗相匹配的二抗，再次孵育;每一步之間用PBS沖洗3次，每次3分鐘;滴加顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間，用蒸餾水充分沖洗;蘇木精復染細胞核;封片，光學顯微鏡下觀察結果。陽性結果判定由本院兩位病理科資深醫師在高倍鏡視野下，進行陽性結果判定;最終結果分為：陽性表達、高表達和低表達。

1.4、統計學方法

采用SPSS26.0統計軟件進行統計學分析。NUCB2和Bcl-2在前列腺癌、前列腺上皮內瘤變及良性前列腺增生組織中的表達差及相關性分析采用 χ2檢驗，以a=0.05為顯著性檢驗水平，P<0.05為差異有統計學意義。

2、結果

2.1、NUCB2、Bcl-2在前列腺癌、前列腺上皮內瘤變及良性前列腺增生組織中的表達。

NUCB2主要表達于腺上皮細胞胞質內，呈棕黃色至棕褐色。NUCB2在BPH、LGPIN、HGPIN及PC組陽性率分別為10%，11.11%，14.29%及70.59%。NUCB2在PC組中的陽性率明顯高于BPH組、LGPIN組和HGPIN組，差異有統計學意義（P<0.05見表1）。

Bcl-2主要表達于正常前列腺的腺上皮細胞以及前列腺癌細胞的細胞質，在BPH、LGPIN、HGPIN及PC組陽性率分別為15%，27.78%，52.29%及76.74%。在PC組中的陽性率明顯高于BPH組、LGPIN組和HGPIN組，差異有統計學意義（P<0.05見表1）。

2.2、NUCB2和Bcl-2的表達與前列腺癌臨床病理參數的關系。

在前列腺癌組織中，NUCB2表達與患者年齡無關;與Gleason評分和術前血清PSA值有關，隨著Gleason評分的增高，NUCB2的表達率也增高，同樣隨著術前血清PSA值的增加，NUCB2的表達率也增高，差異有統計學意義（P<0.05）。<5年生存期病例的NUCB2表達陽性率高于≥5年生存期病例，差異有統計學意義（P〈0.05見表2）。

Bcl-2表達與患者年齡、5年生存率均無關，差異無統計學意義（P>0.05）;與Gleason評分和術前血清PSA值有關，隨著Gleason評分的增高，Bcl-2的表達率也增高，同樣隨著術前血清PSA值的增加，NUCB2的表達率也增高，差異有統計學意義（P>0.05見表2）。

2.3、NUCB2與Bcl-2在高級別上皮內瘤變組HGPIN和高分化前列腺癌PC組中的表達。

NUCB2在高分化PC組中陽性表達率高于HGPIN組，差異有統計學意義（P<0.05），而Bcl-2在高分化PC組中陽性表達率也高于HGPIN組，但差異無統計學意義（（P>0.05見表3）。

2.4、NUCB2表達與PC預后的關系。

預后分析得知，前列腺癌組中，共有40人滿足5年生存率調查。Nucb2組中，<5年生存率的25人中，23人陽性表達，2人陰性表達;≥5年生存率的15人中，9人陽性表達，6人陰性表達，陽性和陰性患者間術后生存差異有統計學意義。

Bcl-2組中，<5年生存率的25人中，18人陽性表達，7人陰性表達;≥5年生存率的15人中，9人陽性表達，6人陰性表達，陽性和陰性患者間術后不生存差異無統計學意義（見表2）。

2.5前列腺癌中NUCB2與Bcl-2表達的相關性

NUCB2、Bcl-2在前列腺癌組織中的表達呈正相關性（見表4）

4、討論

前列腺癌患者主要是老年男性，近年來呈現明顯上升趨勢，目前前列腺癌位居我國男性泌尿生殖系統惡性腫瘤中發病率的第三位^[6]。因此，因此，對于前列腺癌的發生、發展和診斷已經成為一個重要的課題。

NUCB2也稱為NEFA蛋白，是一種新的腫瘤相關基因，最近研究發現與乳腺癌的復發和不良預后密切相關^[7]，而且體外細胞實驗結果顯示能夠有效的增加乳腺癌細胞系的增殖，轉移和侵襲能力。所有的結果顯示和乳腺癌的轉移密切相關，而且可以作為預測乳癌預后的一個重要指標^[8]。在正常胃組織，Nucb2表達較高，主要陽性分布于胃粘膜泌酸腺內分泌細胞。用RT-PCR法分析和比較胃癌組織中癌組織和癌旁組織中nucb2m?RNA的變化，發現胃癌組織中nucb2m?RNA水平下調了50%，nucb2在胃癌組織中具有典型的抑癌基因[9-10]。

本課題中前列腺癌組Nucb2表達明顯高于前列腺增生組和前列腺上皮內瘤變組（P<0.05），本實驗顯示，在PC組中NUCB2表達與年齡無關，與腫瘤的Gleason分級、術前血清PSA相關，差異有統計學意義，血清PSA—直被認為是前列腺癌的理想分子標志物，血檢測被廣泛應用于前列腺癌的發生、進展、治療后殘余癌的治療及前列腺癌復發后的隨訪等過程中。隨著術前血清PSA值的升高，Nucb2蛋白的表達率也增高。前列腺癌Gleason評分與前列腺癌的生物學行為和臨床預后之間具有很好的關聯性，隨著Gleason分級的增加，評分越高，前列腺癌分化越差，NUCB2表達率越高，提示NUCB2表達可能與癌癥的進展和分化有關。NUCB2在<5年與≥5年生存期病例中的表達存在差異，差異有統計學意義，提示Nucb2的異常表達可能與前列腺癌的預后有關。HGPIN目前認為是一種癌前病變，組織學形態及其組織的生物學行為以及與PC類似并有關聯，尤其是高分化前列腺癌。這組課題表明，高分化PC組的Nucb2陽性表達率高于HGP?IN組，差異有統計學意義，提示其可用于鑒別診斷。

本實驗中顯示Bcl-2在前列腺癌組中的表達明顯高于良性前列腺增生組和前列腺上皮內瘤變組，差異有統計學意義，提示bcl-2可能參與了前列腺癌的發生。在PC組中Bcl-2表達與年齡無關，與腫瘤的Gleason分級、術前血清PSA相關，差異有統計學意義，隨著Gleason分級的增加，Bcl-2表達率越高，提示Nucb2表達可能與癌癥的進展和分化有關。Bcl-2在<5年與≥5 年生存期病例中的表達有差異，但無統計學無顯著差異，在高分化PC組和HGPIN組中表達存在差異，但無統計學無顯著差異。

通過相關性分析得知NUCB2、Bcl-2在前列腺癌組織中的表達呈正相關性（P<0.05）。由此可以提示NUCB2的高表達引起Bcl-2的高表達，影響細胞凋亡失衡，NUCB2與Bcl-2兩者間存在一種相互作用機制在前列腺癌中發揮作用，對前列腺癌的發生、發展密切相關，檢查其表達水平對疾病鑒別診斷和治療預后有一定幫助，對鑒別高分化PC和中HGPIN有一定意義。目前NUCB2 與 Bcl-2之間的相互關系以及生物學功能方面的研究還比較少，尤其是在腫瘤中的相互作用機制，需要擴大樣本進行更詳細的研究。

參考文獻

[1]VERMASSEN T，VAN PRAET C，VANDERSCHAEGHE D，etal. Capillary electrophoresis of urinary prostate glycoproteinsassists in the diagnosis of prostate cancer[J].Electrophoresis，2014，35（7）：1017-1024.

[2]韓蘇軍，張思維，陳萬青，等.中國前列腺癌發病現狀和流行趨勢分析[J].臨床腫瘤學雜志，2013，18（4）：330-334.

[3]葉定偉，朱耀.中國前列腺癌的流行病學概述和啟示[J].中華外科雜志，2015，53（4）：249-252.

[4]Kanai Y，Tanuma S.Purifiaction of a novel B cell growth and dif- ferentiation factor associated with lupus syndrome[J].Immunol Lett，1992，32（1）：43-48.

[5]Wang G，Reed E，Li QQ.Apptosis in? prostate cancer：progressive and therapeutic implications（Review）[J].Int JMol Med，2004，14;23-34.

[6]Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[7]Suzuki S，Takagi K，Miki Y，et al. Nucleobindin 2 in human breast carcinoma as a potent prognostic factor[J]. Cancer Sci，2012，103：136-143.

[8]Suzuki S，Takagi K，Miki Y，et al.Nucleobindin 2 in human breast carcinoma as a potent prognostic factor[J].Cancer Sci，2012，103：136-143.

[9] A Line ， A Stengre vics ， Z Slucka 1， et al.Serological identification and expression analysisof gastric cancer-associated genes[J].British Journal of Cancer ，2002，86， 1824–1830.

[10]Stengel A， Goebel M， et a1.Identification and characterization of nesfatin-1 immunoreactivity in endocrine cell types of the rat gastric oxyntic mucosa [J].Endocrinology，2009，150（11）：232-238.