冬蟲夏草多糖單糖組成及免疫活性研究

趙彪希,張海德,張媚健,李文佳,甄達明,錢正明,陳海明,*

(1.海南大學食品科學與工程學院,海南?？?570208; 2.廣東東陽光藥業有限公司,廣東東莞 523871)

冬蟲夏草主要產于我國的青海、西藏、四川、云南、甘肅五省的高寒地帶和雪山草原,是麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordycepssinensis(BerK.)Sacc。寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的復合體,是我國傳統的名貴中藥,具有補腎益肺、止血化痰的功效[1]。研究表明冬蟲夏草含有多種藥理活性物質,如多糖、核苷、氨基酸、糖醇、甾醇等[2],其中多糖是冬蟲夏草中重要的藥理活性物質之一,多糖主要通過促進巨噬細胞增殖,增強巨噬細胞吞噬能力,促進活性氧和一氧化氮生成,提高細胞因子分泌等多個途徑調節巨噬細胞活性,從而增強宿主防御能力[3]。鮮冬蟲夏草為冬蟲夏草的新鮮品,其活性成分沒有受到干燥工藝和應急代謝等影響[4],具有有效成分含量高、藥理活性強等優點[5-6]。目前已從蟲草中分離出多個多糖組分,不同來源的多糖其單糖組成存在差異,天然冬蟲夏草多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成,而發酵菌絲體多糖除含有以上三種單糖,還含有糖醛酸,而對鮮冬蟲夏草多糖的研究鮮有報道[7-8]。

本研究以鮮冬蟲夏草為原料,采用水提醇沉法、Sevag脫蛋白法及透析等方法獲得鮮冬蟲夏草粗多糖(FCSP),然后通過比色法、HPGPC-MALLS、FT-IR及HPAEC-PAD等方法對FCSP的純度、分子量分布、單糖組成進行了研究,并評估了FCSP對巨噬細胞活性的影響,以期為冬蟲夏草多糖在增強免疫方面的應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮冬蟲夏草 廣東東陽光藥業有限公司,經錢正明博士和陳海明教授鑒定為冬蟲夏草Cordycepssinensis(BerK.)Sacc;無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸、無水甲醇 分析級,西隴科學股份有限公司;透析袋 3.5 kDa,上海源葉生物科技有限公司;無水葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA) 對照品,上海詩丹德生物技術有限公司;考馬斯亮藍試劑盒 南京建成科技有限公司;系列葡聚糖標準品(12、25、50、80、150、410、670 kDa) 美國Sigma-Aldrich;三氟乙酸(TFA)、溴化鉀(KBr) 色譜級,美國aladdin公司;MTT試劑盒、Human TNF-αELISA 試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

CO2恒溫培養箱、Dionex ICS-5000離子色譜系統 美國Themofisher公司;1260 Ⅱ型高效液相色譜(配備蒸發光散射檢測器) 美國Agilent公司;多功能酶標儀 美國BioTek公司;真空冷凍干燥機 上海Tofflon公司;傅立葉紅外變換光譜(FT-IR) 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖提取純化 取鮮冬蟲夏草200 g,粉碎,加80%乙醇1 L加熱至微沸,回流提取2 h以除去脂肪、色素及小分子組分,過濾,取濾渣并揮干。殘渣加2 L純水,煮沸回流提取2 h,共提取3次,用紗布過濾,合并濾液,45 ℃減壓濃縮。向濃縮液中緩慢加入4倍體積無水乙醇,于4 ℃靜置過夜,傾出乙醇取沉淀并用熱水復溶,5000 r/min離心10 min,上清液用Sevag法[9]脫蛋白11次。減壓濃縮脫蛋白溶液,并用3.5 kDa透析袋透析48 h,過0.45 μm濾膜,冷凍干燥,即得鮮冬蟲夏草粗多糖(FCSP)。

1.2.2 多糖含量測定 以無水葡萄糖作為對照品,用苯酚-硫酸法[10]測定FCSP多糖含量。吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的葡萄糖對照品溶液以及0.1 mg/mL的FCSP溶液各1.0 mL于9支10 mL比色管中(FCSP溶液設三組平行),分別加5%苯酚1 mL,濃硫酸5 mL,密塞混勻,靜置30 min,測量490 nm處吸光值。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光值(A490)為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程y=7.6458x+0.0118,R2=1.0000,根據回歸方程計算FCSP中總糖含量。

1.2.3 蛋白含量測定 以牛血清白蛋白(BSA)作為對照品,用Bradford法[11]測定FCSP中蛋白含量。吸取0、62.5、125、250、500、1000 μg/mL的BSA對照品溶液以及10 mg/mL的FCSP溶液各100 μL于9只10 mL比色管中(FCSP溶液設三組平行),分別加5 mL考馬斯亮藍染色液,混勻,靜置5 min,測量595 nm處吸光值。以BSA濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值(A595)為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程y=0.8464x+0.0395,R2=0.9931,根據回歸方程計算FCSP中蛋白含量。

1.2.4 分子量分布分析

1.2.4.1 樣品處理 將FCSP和葡聚糖系列標準品分別溶于20 mmol/L乙酸銨中,過0.45 μm濾膜,用高效滲透凝膠色譜聯用蒸發光散射檢測器(HPGPC-ELSD)測定FCSP分子量分布[12]。

1.2.4.2 色譜條件 色譜柱:TSKgel G5000PWXL(7.8 mm×30 cm,10 μm)及保護柱TSKgel guardcolumn PWXL(6.0 mm×4 cm);流動相:20 mmol/L乙酸銨,等度洗脫;流速:0.6 mL/min;蒸發溫度:30 ℃;漂移管溫度:30 ℃;載氣:空氣;增益值:1.0。

1.2.4.3 標準曲線的建立 以葡聚糖系列標準品分子量的對數值(lg Mw)對保留時間(Time)進行線性回歸分析,得分子量校正曲線y=-0.3725x+10.59,R2=0.9960。根據樣品溶液中各色譜峰的保留時間,由校正曲線求得相應的分子量。用面積歸一化法計算各組分所占的比例。

1.2.5 單糖組成分析

1.2.5.1 樣品處理 取FCSP約10 mg于鉗口瓶,加入2 mL TFA(2 mol/L)溶解、氮封,于120 ℃水解2 h,冷卻至室溫。水解液加入1 mL甲醇,氮吹揮干,重復3次。揮干后樣品用1 mL超純水復溶,稀釋至合適濃度,據參考文獻[13]用離子色譜分析,條件略作修改。

1.2.5.2 色譜條件 色譜柱CarboPac PA20(3 mm×150 mm)及保護柱CarboPac PA20 Guard Column(3 mm×50 mm)配備脈沖安培檢測器,洗脫梯度見表1。

表1 離子色譜洗脫梯度Table 1 Elution gradient of HPAEC-PAD

1.2.6 紅外光譜分析 根據參考文獻[14],將FCSP與干燥的KBr混勻壓片,用傅立葉紅外變換光譜儀在4000～400 cm-1范圍進行掃描分析。

1.2.7 FCSP的免疫活性研究 根據參考文獻[15-16],測定FCSP對RAW 264.7細胞增殖和產生NO、TNF-α的影響。小鼠巨噬細胞株RAW 264.7用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養基在恒溫恒濕培養箱(37 ℃,5% CO2)中孵育培養。將處于對數生長期的細胞用培養基調整細胞濃度至2.0×105cell/mL接種到96孔板(100 μL/孔),培養24 h。細胞貼壁后除去舊的培養基,實驗組加入用培養基溶解的FCSP溶液,使FCSP終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100和200 μg/mL,陽性對照組加入100 μL LPS使其終濃度為1 μg/mL,空白對照組加入100 μL培養基,不含細胞的培養基作為空白組,每組設三個平行孔。繼續孵育24 h后,用MTT法測定RAW 264.7細胞的增殖活性,用NO檢測試劑盒和酶聯免疫試劑盒分別測定NO和細胞因子TNF-α的濃度。

1.3 數據處理

數據以測定結果的平均值表示,采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行方差分析用于數據的顯著性檢驗,P<0.05(*)表示數據間具有顯著差異,P<0.01(**)表示數據間具有極顯著差異;用Origin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 FCSP得率、多糖含量及蛋白含量

鮮冬蟲夏草經過脫脂、水提醇沉、Sevag法脫蛋白和透析獲得鮮冬蟲夏草多糖FCSP,其多糖得率為0.46%。用苯酚-硫酸法測得FCSP的總糖含量為84.94%,用Bradford法測得FCSP的蛋白含量為2.49%。

2.2 分子量分布分析

FCSP經HPGPC-ELSD分析并通過葡聚糖線性回歸方程及面積歸一化法計算可知(表2,圖1),FCSP主要由三個分子量多糖組成,分子量分別為1.186×104、1.070×103、2.115×10 kDa,分別占比3.510%、24.232%和72.258%。

表2 FCSP分子量分布及其比例Table 2 Molecular weight distribution and its ratio of FCSP

圖1 FCSP分子量分布色譜圖Fig.1 Molecular weight distribution chromatogram of FCSP注:峰1～3分子量分別為1.186×104、 1.070×103、2.115×10 kDa。

2.3 單糖組成分析

FCSP經離子色譜分析顯示(表3,圖2),FCSP由葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和半乳糖(Gal)組成,單糖組成百分比為Glc∶Man∶Gal=59.13∶21.73∶19.14。

表3 FCSP單糖組成Table 3 Monosaccharides composition of FCSP

圖2 FCSP單糖組成離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of FCSP monosaccharides composition

2.4 FT-IR分析

FCSP的紅外光譜如圖3所示,3367 cm-1顯示一明顯寬峰,為O-H伸縮振動峰;2931 cm-1處為甲基或亞甲基的C-H振動峰;1420～1200 cm-1范圍內為C-H的變角振動峰,以上三個區域的吸收峰可判定FCSP具有糖類結構[17]。1740 cm-1附近無吸收峰,說明FCSP不含糖醛酸[18],1081、1024和814 cm-1處分別為半乳糖、葡萄糖和甘露糖的特征吸收峰[19-20],以上信息與單糖組成分析結果一致。1651 cm-1為結合水峰[21]。1562、1531 cm-1為N-H的變角振動峰[22],說明FCSP可能為糖蛋白綴合物或含有蛋白質,與蛋白含量測定結果一致。1150～1010 cm-1區域內三個吸收峰及854 cm-1處的吸收峰表明FCSP中含有α-吡喃糖[19-21]。

圖3 FCSP紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrogram of FCSP

2.5 FCSP的免疫活性研究

巨噬細胞是單核吞噬細胞,在參與機體代謝、免疫防御和體內穩態調節等方面起關鍵作用[23]。巨噬細胞可以對外部刺激作出反應,迅速改變其生理狀態,并通過釋放生長因子、趨化因子和細胞因子到細胞周圍而引發炎癥反應進而被激活[24]。因此,本文用巨噬細胞模型研究多糖的免疫活性作用。

2.5.1 FCSP對RAW 264.7細胞增殖活性的影響 從圖4結果可知,與空白對照組相比,不同濃度的FCSP均能夠極顯著(P<0.01)地促進RAW 264.7巨噬細胞增殖,且增殖率均高于LPS陽性對照組。在低濃度范圍內(6.25～50 )μg/mL,RAW 264.7的細胞增殖率呈劑量依賴型。當FCSP濃度為50 μg/mL時,細胞增殖率為155.50%,達到最大效應,故隨著FCSP濃度的繼續升高,細胞增殖率無顯著變化。

圖4 FCSP對RAW 264.7細胞增值率的影響Fig.4 Effect of FCSP on proliferation of RAW 264.7 cells注:*代表差異顯著(P<0.05),**代表差異極顯著(P<0.01)。圖5、圖6同。

2.5.2 FCSP對RAW 264.7細胞NO釋放量的影響 NO是一種重要的信號分子,在人體很多組織中調節多種生理過程,檢測在多糖刺激下巨噬細胞上清液中亞硝酸鹽濃度即可判斷NO的產生量[25]。由圖5結果可知,FCSP處理組釋放NO的效果弱于LPS陽性對照組;與空白對照組相比,低濃度(6.25～50) μg/mL的FCSP對細胞NO釋放量無顯著(P>0.05)影響,高濃度(100～200) μg/mL的FCSP能極顯著(P<0.01)促進巨噬細胞釋放NO,并呈現劑量依賴型,當FCSP濃度達到200 μg/mL時,細胞NO釋放量達到最高為12.75 μmol/L。

圖5 FCSP對RAW 264.7細胞NO釋放量的影響Fig.5 Effect of FCSP on NO production of RAW 264.7 cells

2.5.3 FCSP對RAW 264.7細胞TNF-α釋放量的影響 檢測細胞因子的產生量是表征人體免疫反應變化的一種簡便方法,TNF-α等細胞因子的含量水平在衡量免疫調節作用中起著重要作用[26]。從圖6可知,與空白對照組相比,不同濃度的FCSP均能夠極顯著(P<0.01)增強細胞對TNF-α的釋放且具有明顯的劑量依賴型。當FCSP濃度達到12.5 μg/mL時,RAW 264.7細胞對TNF-α的釋放量超過LPS陽性對照組;當FCSP濃度為200 μg/mL時,RAW 264.7細胞對TNF-α的釋放量達到最高,為2785.33 pg/mL。結果表明,FCSP能極顯著(P<0.01)促進巨噬細胞分泌TNF-α。

圖6 FCSP對RAW 264.7細胞TNF-α釋放量的影響Fig.6 Effect of FCSP on TNF-α production of RAW 264.7 cells

3 結論

本研究以鮮冬蟲夏草為原料通過脫脂、水提醇沉、脫蛋白和透析,獲得多糖FCSP,得率為0.46%。FCSP中多糖含量為84.94%,蛋白含量為2.49%;其主要含有分子量分別為1.186×104、1.070×103和2.115×10 kDa的三個多糖組分,并由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成,含量分別為59.13%、21.73%和19.14%,紅外光譜結果印證了FCSP的單糖組成及其多糖的本質。本研究結果顯示,FCSP對促進RAW 264.7巨噬細胞增殖和釋放NO、TNF-α具有極顯著(P<0.01)作用,且呈現明顯的劑量依賴效應,表明FCSP可作為良好的免疫調節劑。本研究為冬蟲夏草多糖產品的開發和應用提供了理論依據。