三疣梭子蟹脂肪提取工藝及其組成分析

卜俊芝,徐 迅,嚴利強

(浙江旅游職業學院,浙江杭州 311231)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是一種重要的海洋經濟動物,由于其個體大、生長快、風味鮮美、營養豐富等特點,已經在我國海洋捕撈和海水養殖中占有極其重要的地位。其蟹肉的脂肪富含不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFA),含量高達40%,尤其是C20∶5n3(EPA)和 C22∶6n3(DHA)[1]。有研究表明飽和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)會引起血清總膽固醇升高,單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)卻具有保護心臟、降血糖、調節血脂、降低膽固醇和防止記憶下降等諸多作用[2],同時多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)有降血脂防動脈硬化、提高人體免疫機能等重要功能[3]?？墒?我國相關梭子蟹產品主要是新鮮梭子蟹和剝制的蟹肉,對梭子蟹的加工還處于簡單的初級階段，對蟹肉脂肪還沒有進一步的精深加工。隨著我國國民生活水平的提高,市場對蟹產品的多樣化提出了更高要求。

目前,有關三疣梭子蟹的研究大多集中于養殖技術[4-7]和基礎的營養及風味研究[1,8-10]。進一步針對三疣梭子蟹脂肪的研究極少[1，10]。脂肪分析方法常用索氏提取、氯仿甲醇法、稀堿水解法、酶法等[11-16]脂肪提取方法和脂肪酸的酸堿酯化法[17-20]。由于實驗條件的限制,不同實驗室采取的提取和甲酯化方法各異,使用的溶劑亦種類繁多,這對脂肪酸測定結果造成的影響千差萬別,很難實現脂肪酸的準確測定。螃蟹脂肪酸分析方法的標準化,有利于不同海域螃蟹脂肪酸的對比研究以及促進螃蟹的精深加工。

因此,針對三疣梭子蟹肥美的脂肪,本文將常用的4種脂肪提取方法及5種常見甲酯化方法進行了系統的比較,找出最適合螃蟹脂肪的提取及分析方法,從而獲得三疣梭子蟹的蟹肉脂肪酸組成特征,期望為三疣梭子蟹的營養研究提供理論數據,也為水產品脂肪精深加工提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的雄性三疣梭子蟹 捕撈于浙江舟山海域,選取大小均勻,體重均200 g。

石油醚(沸程:60～90 ℃)、丙酮、氯仿、甲醇(提取脂肪) 分析純,成都市科龍化工試劑有限公司;三氟化硼(脂肪酸甲酯化，分析純)、正己烷(提取甲酯化的脂肪，色譜純) 國藥集團化學試劑有限公司;37種脂肪酸甲酯標準品 色譜純,上海Sigma-aldrich公司。

Agilent GC-7890A氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;離心機 美國賽默飛世爾公司;XH-MC-1 實驗室微波合成儀 上海祥鴿智能科技有限公司;IKA?T18均質機 上海楚柏實驗室設備有限公司;N-EVAP111 氮吹儀 北京康林科技有限公司;JB-3型定時恒溫磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司;RE-52 AAA 旋轉蒸發器 上海嘉鵬科技有限公司;PTS-300超聲發生器 廣州東方超聲設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酸甲酯標準溶液的配制 37種脂肪酸甲酯標準品用色譜純正己烷稀釋5倍,過0.45 μm有機濾膜后進氣相色譜分析。

1.2.2 三疣梭子蟹樣品的前處理 三疣梭子蟹冰浴條件下運到實驗室,立即清洗干凈后,蒸20 min,去除鰓、胃、心、腸、性腺,剪開步足和頭胸甲底部內骨骼,刮出肌肉作為蟹肉,并在冰浴的條件下均質,真空包裝。樣品置于冰箱冷凍室中(-20 ℃)保存。

1.2.3 三疣梭子蟹脂肪提取方法 梭子蟹的脂肪提取參照如下不同的提取方法提取,得到的粗脂肪測定脂肪得率。利用常規三氟化硼-甲醇甲酯化后,氣相色譜進行分析,得到飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸相對百分含量。

1.2.3.1 索氏提取法 參照王洪英等[11]的方法,具體方法如下。新鮮蟹肉去水處理,取蟹肉(干樣)10 g,濾紙封好放于索氏提取器中,提取溶劑為丙酮-石油醚溶液(1∶1,v/v),料液比為1∶6 g/mL,于75 ℃恒溫水浴回流8 h,真空旋轉蒸發去除有機溶劑,得到粗脂肪,測定其脂肪提取率。充氮氣密封4 ℃保存。甲酯化方法采用一步BF3法處理。

1.2.3.2 Bligh-Dyer提取法 參照刁全平等[12]的方法,具體方法如下。稱取蟹肉(濕樣)20 g于500 mL錐形瓶中,加入100 mL甲醇、50 mL氯仿、40 mL蒸餾水,均質后,磁力攪拌器攪拌20 h,加入50 mL氯仿,50 mL蒸餾水,真空抽濾,取下層有機相,旋轉蒸發去除氯仿,得到粗脂肪,測定其脂肪提取率。充氮氣密封4 ℃保存。甲酯化方法采用一步BF3法處理。

1.2.3.3 超聲提取法 參照汪學榮等[13]的方法,具體方法如下。稱取蟹肉(濕樣)20 g于500 mL錐形瓶中,以甲醇-氯仿-水(1∶1∶0.9,v/v/v)作為溶劑,固液比1∶5 g/mL,均質后靜置20 h,以超聲功率400 W、超聲時間25 min,重復超聲3次,混合提取液,5000 r/min離心5 min,取下清液,旋轉蒸發去除氯仿,得到粗脂肪,測定其脂肪提取率。充氮氣密封4 ℃保存。甲酯化方法采用一步BF3法處理。

1.2.3.4 微波萃取法 參照李朝陽等[14]的方法,具體方法如下。稱取蟹肉20 g(濕樣)于250 mL錐形瓶中,提取溶劑用無水乙醇-石油醚(4∶1,v/v),料液比為1∶5 g/mL,微波輻射功率640 W,設定溫度為40 ℃,輻射時間60 s,萃取后磁力攪拌40 min,真空抽濾,取上層有機相,旋轉蒸發去石油醚,得到粗脂肪,測定其脂肪提取率。充氮氣密封4 ℃保存。甲酯化方法采用一步BF3法處理。

1.2.4 三疣梭子蟹脂肪酸甲酯化處理方法 粗脂肪均由同樣的Bligh-Dyer方法抽提得到,分別用經優化后的5種甲酯化方法進行甲酯化,然后進氣相色譜進行分析,得到各類脂肪酸的相對百分含量。

1.2.4.1 酸法甲酯化 參照傅向乾等[17]的方法,具體方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入1%硫酸-甲醇(V/V)2 mL,70 ℃水浴加熱60 min,加2 mL正己烷,混勻,靜置分層,收集上清液,加適量無水硫酸干燥,經氮吹濃縮后進氣相分析得到脂肪酸組成結果。

1.2.4.2 室溫堿法甲酯化 參照傅向乾等[17]的方法,具體方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入石油醚-苯混合溶劑(1∶1,v/v)2 mL溶解脂肪,加2 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液,超聲頻率30 kHz,反應時間10 min,室溫靜置30 min,加蒸餾水1 mL,振搖,靜置分層后取上層,加適量無水硫酸鈉干燥后,經氮吹濃縮后進氣相分析得到脂肪酸組成結果。

1.2.4.3 酸堿酯化法 參照張述瓊等[19]的方法,具體方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液4 mL,于60 ℃水浴中皂化至無油滴(約20 min)。冷卻到室溫,滴加50%硫酸調節溶液呈中性,加入8 mL 1%硫酸-甲醇溶液酯化反應30 min,取出冷卻至室溫,加入5 ml正己烷,加入2 mL飽和NaCl,振搖,靜置分層取上層,用無水硫酸鈉干燥后,經氮吹濃縮后進氣相分析得到脂肪酸組成結果。

1.2.4.4 常規三氟化硼(BF3)-甲醇法 參照符貴紅等[18]的方法,具體方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液3 mL,充氮氣混勻,65 ℃水浴中皂化20 min,冷卻至室溫,加4 mL BF3-甲醇(14%,w/v)混合溶液,60 ℃水浴反應5 min,取出冷卻至室溫,超聲功率300 W,超聲頻率30 kHz,超聲10 min,各加2 mL飽和氯化鈉溶液和正己烷,振蕩5 s,靜置分層取上層,用無水硫酸鈉干燥,經氮吹濃縮后進氣相分析得到脂肪酸組成結果。

1.2.4.5 一步BF3法 參照Pedro等[20]的方法,具體方法如下。取蟹油粗品20 mg,加入2 mL BF3-甲醇溶液(14%,w/v),充氮氣密封,在100 ℃恒溫水浴1 h。冷卻后加1 mL正己烷,2 mL蒸餾水后,振蕩15 s,3000 r/min離心5 min,收集上層。下層加1 mL正己烷重新提取兩次,合并上層,經氮吹濃縮后進氣相分析得到脂肪酸組成結果。

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 氣相色譜測定條件 色譜柱:HP-INNOWAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.15 μm);程序升溫條件:初溫50 ℃,保持2 min,以4 ℃/min升至220 ℃,保持15 min;進樣口溫度250 ℃,分流比為200∶1;進樣量為1 μL;載氣:高純N2;恒流:0.65 mL/min。

1.2.5.2 脂肪酸定性和定量分析 采用37種脂肪酸甲酯標準品的保留時間與試樣組分峰的保留時間進行對照,確定脂肪酸總離子流圖中各色譜峰歸屬,然后采用峰面積歸一化法進行定量分析,求得各個脂肪酸在總脂肪酸中的相對百分含量。

1.2.5.3 脂肪得率的測定

式中:W表示脂肪得率,%;m0為蟹肉的濕重,g;m1為提取錐形瓶的質量,g;m2為提取錐形瓶和脂肪的總質量,g。

1.2.6 三疣梭子蟹肉脂肪酸的組成特征和營養評價 采用脂肪得率及脂肪酸總數為指標,確定最佳脂肪提取方法及酯化方法,采用最佳條件處理蟹肉脂肪,進氣相分析得到脂肪酸組成結果。組成脂肪的脂肪酸種類很多,但大致分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)這三大類。飽和脂肪酸會引起血清總膽固醇升高,單不飽和脂肪酸卻具有保護心臟、降血糖、調節血脂、降低膽固醇和防止記憶下降等諸多作用,同時多不飽和脂肪酸有降血脂防動脈硬化、提高人體免疫機能等重要功能[21]。因此本文參考文獻[21-22]計算三疣梭子蟹脂肪酸致血栓形成指數(thrombogenic index,TI)和動脈粥樣硬化指數(atherogenic index,AI)來評估三疣梭子蟹飽和脂肪酸對人類心血管疾病患病的影響,同時以不飽和脂肪酸含量,以及n-3/n-6系不飽和脂肪酸的比值來評估三疣梭子蟹不飽和脂肪酸對人體健康的影響。

式中:AI表示動脈粥樣硬化指數;C12∶0表示C12∶0的相對含量,%;C14∶0表示C14∶0的相對含量,%;C16∶0表示C16∶0的相對含量,%;C18∶0表示C18∶0的相對含量,%;PUFAn-3表示n-3系多不飽和脂肪酸的相對含量,%;PUFAn-6表示n-6系多不飽和脂肪酸的相對含量,%。

1.3 數據分析

樣品重復測定三次,所獲結果用SPSS 17處理,以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示;采用Duncan多重比較進行差異顯著性分析,以P<0.05作為差異顯著性判斷標準;采用Origin 10.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蟹肉脂肪提取方法

采用37種脂肪酸甲酯標準品總離子流圖中各色譜峰歸屬,見圖1。

圖1 37種脂肪酸標準品的總離子流圖譜Fig.1 Total ion chromatogram of 37 fatty acid standards

四種脂肪提取方法得到的三疣梭子蟹脂肪酸相對百分含量見表1。四種提取方法的得率及獲得的各類脂肪酸數量見表2。由表1和表2可知,四種提取方法所得油脂成分及相對含量有所差異。Bligh-Dyer提取方法在得率和脂肪酸總個數方面有明顯的優勢,而且二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量遠遠高于其他三種提取方法(P<0.05)。超聲提取方法的脂肪酸組成種類和Bligh-Dyer提取方法相差不大,但是DHA的含量較低,而且提取率也較低。索氏提取方法獲得的脂肪酸種類最少,飽和脂肪酸含量最高(P<0.05),而且沒有檢測到EPA和亞麻酸。微波提取方法獲得的脂肪酸中不飽和脂肪酸的比例最高(P<0.05),其中的油酸、亞油酸和亞油酸含量較高,但是EPA和DHA含量較低(P<0.05)。

表1 四種提取方法的三疣梭子蟹肉脂肪酸組成及相對含量Table 1 Fatty acid composition and relative content of Portunus trituberculatus extracted by four methods

表2 四種提取方法效果綜合比較Table 2 The comprehensive comparison of the four extraction methods

索氏抽提脂肪得率低,這可能與其方法使用的溶劑丙酮極性低于其他方法所用的甲醇、乙醇有關,因為溶劑極性大小與物料脂肪的極性大小相一致,得率才會高[23]。索氏抽提獲得的飽和脂肪酸含量最高,不飽和脂肪酸含量顯著(P<0.05)降低,這實驗結果與金春愛等[24]研究結果一致,這和索氏提取經高溫回流,可能會造成多不飽和脂肪酸在提取過程中變性而減少有關。因而脂肪酸的提取方法是影響脂肪酸檢測結果的一個重要因素。Bligh-Dyer法的得率約是超聲的2倍,還保留了更多的多不飽和脂肪酸,這說明超聲波對提取蟹肉脂肪的貢獻不是非常大。這和汪學榮等[13]、趙麗華等[25]報道一致,對得率的影響最大的是料液比和提取溫度,而超聲功率與超聲時間影響較小。微波提取方法的得率較低,可能提取操作方法需要進一步優化。

綜合提取率、提取溫度、提取時間、所用原料的前處理方便性,以及提取獲得的多不飽和脂肪酸含量等指標考慮,得出Bligh-Dyer是最適蟹肉脂肪的提取方法。

2.2 蟹肉脂肪酸甲酯化方法比較

5種甲酯化方法獲得的三疣梭子蟹肉脂肪酸組成見表3。5種甲酯化方法檢測到的脂肪酸數量見表4。常見的甲酯化方法分為酸催化、堿催化、酸堿結合甲酯化和BF3甲酯化法[26]。由表3和表4可知,酸法和常規BF3得到的脂肪酸個數較多,均為20個,而且不飽和脂肪酸含量均高于堿催化甲酯化方法,而且在堿法和酸堿法催化甲酯化方法得到的結果中未發現EPA。常規BF3和酸法甲酯化比較,其EPA和DHA含量均較高,而且總不飽和脂肪酸含量顯著高于其他四種方法(P<0.05)。一步BF3得到的脂肪酸總個數最多,但是其UFA含量顯著低于其他四種方法(P<0.05)。

表4 五種甲酯方法的綜合效果比較Table 4 Comprehensive comparison of the methyl esterification methods

不同的甲酯化方法各有其優缺點,適用對象和測定的結果也各不相同。氫氧化鉀甲醇堿催化與硫酸甲醇酸催化過程中,游離脂肪酸與甲醇反應均會生成水,水會導致氫氧根自由基的生成,這些氫氧根自由基會樣品中的酯和新生成的脂肪酸甲酯發生水解反應,從而削弱堿酯化效果[27]。本實驗結果也表明酸甲酯化和堿甲酯化獲得的脂肪酸個數、不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量均比常規BF3低。酸催化甲酯化方法和堿催化甲酯化方法相比較,前者的效果優于后兩者,可能是酸催化甲酯化環境要求較溫和[28],說明相對于堿性催化法來說酸性催化法能提供更加穩定的反應條件[29]。而室溫堿法和酸堿法甲酯化效果相比較,后者優于前者,這說明甲酯化前的堿皂化有利于酸甲酯化。一步BF3法雖然得到的脂肪酸個數最多,同時不飽和脂肪酸的個數也最多,但PUFA含量最低,SFA含量最高,可能是加熱溫度過高(100 ℃),時間過長(1 h)導致多不飽和脂肪酸分解造成的。而常規BF3獲得的脂肪酸種類最豐富的,不飽和脂肪酸含量高,這可能與其反應機理密切相關,鹽酸的酸化調節可使反應溶液始終處于酸性條件,有利于脂肪酯化,另外BF3作為酸性催化劑,能夠消耗反應體系中存在的水并形成硼酸,有利于促進甲酯化反應的正向進行,且不會破壞不飽和脂肪酸[30]。

綜上所述,從實驗條件要求、甲酯化效率、脂肪酸種類豐富性及不飽和脂肪酸的含量等方面考慮,常規BF3是最適蟹肉脂肪酸甲酯化方法。

2.3 三疣梭子蟹肉脂肪酸的組成特征和營養價值評價

利用Bligh-Dyer提取方法和常規BF3甲酯化方法分析三疣梭子蟹肉脂肪酸組成,總離子流圖見圖2,各脂肪酸組成見表5,脂肪酸的營養價值評價見表6。

表5 三疣梭子蟹肉脂肪酸組成Table 5 Fatty acid composition of Portunus trituberculatus

表6 三疣梭子蟹脂肪酸的營養價值評價Table 6 Nutritional value assessment of fatty acids in Portunus trituberculatus

圖2 三疣梭子蟹脂肪酸的總離子流圖譜Fig.2 Total ion chromatogram of fatty acid in Portunus trituberculatus

結果顯示共檢測出20種脂肪酸,碳鏈長度在14～23之間,C22∶6n3(DHA)、C20∶5n3(EPA)、C18∶1(油酸)和C16∶0(棕櫚酸)是三疣梭子蟹蟹肉的主要脂肪酸。其中飽和脂肪酸占總脂肪酸的39.43%,單不飽和脂肪酸為16.92%,多不飽和脂肪酸為43.65%。飽和脂肪酸中含量最高的脂肪酸是C16∶0(棕櫚酸,12.05%),單不飽和脂肪酸中含量最高的是C18∶1(油酸,13.07%),接著是C16∶1n7(棕櫚烯酸,2.27%),多不飽和脂肪酸中含量最高的是C22∶6n3(DHA,20.24%),接著是C20∶5n3(EPA,15.49%)。各類中的特征脂肪酸和徐善良等[31]使用Bligh-Dyer提取、KOH-甲醇酯化的三疣梭子蟹肉脂肪結果相似,而且EPA和DHA在總脂肪中的比例也相近。但是總脂肪酸中含量最高的脂肪酸不同,其檢測結果是C18∶1(油酸),本文為C22∶6n3(DHA),這可能是性別、攝食、生長環境和捕獲季節不同有關。這結果也和Celik等[32]提出的油酸是海水蟹肉中主要單不飽和脂肪酸這一實驗結果相符合。

綜上所述,脂肪酸的營養價值主要指標是其中的不飽和脂肪酸的比例以及n-3系和n-6系等重要不飽和脂肪酸的含量,特別是EPA和DHA。本實驗得到的三疣梭子蟹肉脂肪酸組成中不飽和脂肪酸占60.57%,尤其EPA和DHA含量高達35.71%,遠高于中華絨螯蟹的5.02%[33-34]、鋸緣青蟹的16.53%[35],也高于海水養殖的鱸魚的17.1%和大黃魚的17.1%[36]。這說明海蟹中PUFAs是主要的脂肪酸,約占總脂肪酸的50%,其中EPA和DHA含量尤其豐富,這和Celik等[32]的研究結果一致。而且三疣梭子蟹肉中n-3系不飽和脂肪酸含量高達35.72%,n-3/n-6的比值5.27，均遠遠高于上述幾類水產品,也遠高于國際糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)推薦的PUFAn-3/PUFn-6日常膳食比(0.1～0.2)[3],較高的PUFAn-3/PUFn-6能有效降低血脂,抑制血小板凝集,降低心血管疾病的發病率[37]。此外,三疣梭子蟹的脂肪酸致動脈粥樣硬化指數(AI)和血栓形成指數(TI)分別為0.22和0.17,遠遠低于羊肉、牛肉和豬肉(AI分別是1.00、0.72、0.60;TI分別為1.58、1.06、1.37)[21],表明三疣梭子蟹的脂肪酸不飽和度高,具有降血脂、軟化血管、抑制冠心病和血栓形成等功能。

3 結論

采用索氏法、Bligh-Dyer法、超聲法和微波萃取法提取三疣梭子蟹脂肪酸,進而利用酸法、室溫堿法、酸堿結合法、常規BF3和一步BF3方法分別甲酯化,比較各提取方法和甲酯化方法效果,結果表明Bligh-Dyer提取方法操作簡便、脂肪得率最高,同時此提取方法和常規BF3-甲酯化方法在不飽和脂肪酸的種類和含量方面均顯示出明顯的優勢。因此,Bligh-Dyer提取方法和常規BF3甲酯化方法是蟹肉脂肪酸分析的最適方法。采用此最適方法分析三疣梭子蟹脂肪酸組成,結果共檢測出20種脂肪酸,其中飽和脂肪酸占總脂肪酸的39.43%,單不飽和脂肪酸為16.92%,多不飽和脂肪酸為43.65%,n-3/n-6比值為5.27,說明三疣梭子蟹肉富含n-3系不飽和脂肪酸。后續工作中將繼續優化脂肪分析條件以提高三疣梭子蟹脂肪的提取率,期望能推動蟹油進一步的加工應用。