桃膠多糖體內外抗氧化作用的研究

蔡延渠,董碧蓮,陳利秋,朱盛山,李苑新,吳燕紅

(廣東藥科大學新藥研發中心,廣東廣州 510006)

近幾年來,在大健康產業背景下,隨著老齡化、城鎮化及消費升級,正推動我國的保健食品和功能性食品快速發展?！丁敖】抵袊?030”規劃綱要》的出臺,意味著“健康中國”上升為國家戰略,健康產業將成為國民經濟支柱性產業[1]。

桃膠為薔薇科植物桃(PrunuspersicaL. Batsch)或山桃(PrunusdavidianaCarr. Franch)等植物的樹皮受損后分泌出來的半透明物質。其主要成分為多糖,含量高達80%以上[2],同時含有少量的蛋白質、氨基酸等,遇水可膨脹,有一定黏性。由于桃膠為天然產物、營養豐富,有清血降脂、滋補養顏及抗皺嫩膚等功效,同時具有韌滑、淡甜的特殊口感,逐漸受到廣大消費者的喜愛,是保健食品開發的重要潛在資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桃膠樣品 采自貴州習水縣,經廣東藥科大學李苑新副研究員鑒定為薔薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch分泌的桃膠樹脂;SPF級昆明雄性小鼠60只 體重(20.0±2.0) g,購于廣東省醫學實驗動物中心,生產許可證號:SYXK(粵)2018-0002;D-無水葡萄糖(批號110833-201707,含量99.9%) 中國食品藥品檢定研究院;維生素C(VC,批號 SLBN3833V) Sigma試劑有限公司;D-半乳糖 上海源葉生物有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Thris)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2,2′-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 上海麥克林生化科技有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

UV-1700雙光束紫外分光光度計 日本島津公司;FreeZone2.5冷凍干燥機 美國Labconco公司;LB940多功能酶標儀 美國BioTek公司;TGL-20M高速冷凍離心機 長沙維爾康湘鷹離心機有限公司;RE-52旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;BP-211D電子分析天平 德國Sartorius公司;pHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桃膠多糖制備 參考徐燕等[12]及任永升等[13]報道的方法,并進行適當改進。將桃膠浸脹、去雜、烘干,粉碎過60目篩,稱取一定量粉末,以水為溶劑(以1%的NaOH溶液調節成pH為10.0),按料液比1∶100 (g/mL)、提取時間4 h、100 ℃提取3次,提取液3500 r/min離心15 min,濾液于75 ℃減壓濃縮至適量,三氯乙酸除蛋白,再透過分子截流量為100000 Da的透析袋,透析液加入95%乙醇至溶液乙醇含量為85%,冰箱4 ℃靜置過夜,取沉淀冷凍干燥,粉碎過100目篩,即得桃膠多糖。

1.2.2 桃膠多糖含量測定 參考蔡延渠等[2]報道的方法,采用苯酚-硫酸法,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖標準溶液(0.1019 mg/mL),加入純水補足至1.0 mL,分別加入5%苯酚溶液1.0 mL,搖勻后加入濃硫酸溶液6.0 mL,90 ℃水浴25 min,取出冷卻至室溫,于紫外分光光度計490 nm處測定吸光度值(A),以葡萄糖質量濃度為橫坐標(X)、A為縱坐標(Y)繪制標準曲線,得到回歸方程。吸取1 mL桃膠多糖溶液,按以上操作反應后測定吸光度值,代入回歸方程計算含量,結果以每克樣品中所含葡萄糖當量的毫克數表示(mg/g)。

1.2.3 桃膠多糖清除自由基能力測定

1.2.3.1 對DPPH自由基清除率測定 參考程軒軒等[14]報道的方法,吸取不同質量濃度桃膠多糖溶液(5～10 mg/mL)及0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液各3 mL,避光反應30 min,于517 nm處測定吸光度值A1;另以等量樣品溶液、無水乙醇混勻后測定A2；等量DPPH溶液、純水混勻后測定A0;VC為陽性對照。通過式(1)計算清除率:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

1.2.3.2 對ABTS自由基清除率測定 參考包騏林等[15]報道的方法,將ABTS用過硫酸鉀溶解配制成終濃度為7.2 mmol/L,室溫避光反應12 h,即ABTS溶液,用前以PBS(pH=7.4)緩沖液稀釋至734 nm處吸光度值A0為0.70±0.02。吸取2 mL不同質量濃度桃膠多糖溶液(0.1～0.6 mg/mL)和4 mL ABTS稀釋液,渦旋30 s,室溫避光反應10 min,于734 nm處測定吸光度值A1;VC為陽性對照。通過式(2)計算清除率:

清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

龐莊水庫上游沒有排污口，點源污染基本不會發生，但也存在。如正在修建的太焦鐵路工程，就出現過污水排入水體情況。

式(2)

1.2.3.3 對OH自由基清除率測定 參考段景峰等[16]報道的方法,吸取不同質量濃度桃膠多糖溶液(0.2～1.2) mg/mL、FeSO4溶液(6 mmol/L)及H2O2(6 mmol/L)溶液各2 mL,混勻靜置10 min;再加入2 mL水楊酸溶液(6 mmol/L),靜置30 min,于510 nm處測定吸光度值A1;另取等量純水代替水楊酸測定吸光度值A2；以純水代替桃膠多糖溶液作為空白對照測定吸光度值A0;VC為陽性對照。通過式(3)計算清除率:

清除率(%)=[1-(A1-A2)]/A0×100

式(3)

清除率(%)=[1-(A1-A2)]/A0×100

式(4)

1.2.4 總還原力測定 參考袁燕等[19]報道的方法,吸取不同質量濃度桃膠多糖溶液各1 mL,依次加入1%鐵氰化鉀溶液與磷酸緩沖液(pH=6.6)各2.5 mL,50 ℃水浴20 min,取出冷卻;再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,混勻,3500 r/min離心15 min,取上清液2.5 mL,加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL和純水2.5 mL,20 min后于700 nm處測定吸光度值。另以純水為空白、VC為陽性對照。

1.2.5 小鼠體內抗氧化實驗 參照《保健食品檢驗與評價技術規范》[20]及鄭飛等[21]報道的實驗方法及條件進行。

1.2.5.1 劑量設計及給藥 環境溫度(20±2) ℃、相對濕度50%±10%,明暗周期各12 h,自由采食喝水。于實驗環境條件適應性喂養3 d,隨機分為6組,12只/組,分別為:空白組、模型組、桃膠多糖組(低劑量2 g/kg、中劑量4 g/kg、高劑量6 g/kg)和VC陽性對照組(0.1 g/kg)。按0.1 mL/10 g進行桃膠多糖組及VC陽性對照組灌胃給藥,1 次/d;空白組及模型組給予等量蒸餾水。除空白組注射生理鹽水外,其余組別每天均按1000 mg/kg劑量進行頸背部皮下注射D-半乳糖,連續45 d。每天觀察小鼠體征、外觀、活動等,每3 d稱重1次以調整注射量和灌胃量。

1.2.5.2 樣品處理 于實驗末次給藥后,禁食不禁水12 h,摘取眼球取血,3500 r/min低溫(4 ℃)離心10 min,取血清于-20 ℃保存備用。小鼠頸椎脫臼處死,摘取肝臟,生理鹽水沖洗干凈,吸干表面水分,取適量肝臟及試劑盒中提取液于研缽中制成10%的組織勻漿,3500 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液備用。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 桃膠多糖含量測定

根據葡萄糖質量濃度與吸光度值繪制標準曲線,得到線性回歸方程:Y=0.0751 X+0.0005(R2=0.9994),代入計算得到桃膠多糖中所含葡萄糖當量為(968.50±8.15) mg/g。

2.2 桃膠多糖體外抗氧化能力評價

2.2.1 清除DPPH自由基能力 對DPPH自由基清除率變化進行曲線繪制(見圖1),得到回歸方程:桃膠多糖清除率Y=9.8200X-18.2470(R2=0.9837),IC50為6.95 mg/mL;VC清除率Y=4.8476X+33.6320(R2=0.9911),IC50為3.38 mg/mL。分析結果可知,在5～10 mg/mL范圍內,隨著濃度的增大,桃膠多糖對DPPH自由基的清除作用逐漸增強;DPPH自由基是很穩定的 N-中心自由基,與機體的許多功能障礙和疾病的發生密切相關,會損傷相鄰的生物分子造成脂質過氧化[22]。因此推測其可能是破壞DPPH自由基中N-中心自由基的穩定性而起到清除作用。與VC相比,桃膠多糖作用較弱。

圖1 桃膠多糖及VC對DPPH自由基清除作用 Fig.1 DPPH free radical-scavenging activities of peach gum polysaccharide and VC

2.2.2 清除ABTS自由基能力 對ABTS自由基清除率變化進行曲線繪制(見圖2),得到回歸方程:桃膠多糖清除率Y=66.5371X+12.4953(R2=0.9855),IC50為0.56 mg/mL;VC清除率Y=1351.0286X+27.2253(R2=0.9804),IC50為 0.017 mg/mL。分析結果可知,在0.1～0.6 mg/mL范圍內,隨著濃度的提高,桃膠多糖對ABTS自由基的清除作用逐漸增強;ABTS自由基較穩定,主要是其結構中N原子上有個成單電子,可與苯環形成p-π共軛,因此推測桃膠多糖能與ABTS自由基的成單電子進行配對,破壞p-π共軛體系,從而起到清除作用。與VC相比,桃膠多糖作用較弱。

圖2 桃膠多糖及VC對ABTS自由基清除作用Fig.2 ABTS free radical scavenging activities of peach gum polysaccharide and VC

2.2.3 清除OH自由基能力 對OH自由基清除率變化進行曲線繪制(見圖3),得到回歸方程:桃膠多糖清除率Y=29.6571X+17.5067(R2=0.9880),IC50為1.10 mg/mL;VC清除率Y=84.9714X+21.5800(R2=0.9915),IC50為 0.33 mg/mL。分析結果可知,在0.2～1.2 mg/mL范圍內,隨著濃度的提高,桃膠多糖對OH自由基的清除作用逐漸增強;表明桃膠多糖能夠清除OH自由基,阻止其降解DNA、細胞膜和多糖化合物,從而保護細胞完整性。與VC相比,桃膠多糖作用較弱。

圖3 桃膠多糖及VC對OH自由基清除作用Fig.3 ·OH scavenging activities of peach gum polysaccharide and VC

圖4 桃膠多糖及VC對自由基清除能力 free radical scavenging activities of peach gum polysaccharide and VC

圖5 桃膠多糖及VC的還原能力Fig.5 Reducing power of peach gum polysaccharide and VC

2.3 總還原能力評價

分析結果可知,在0.02～0.14 mg/mL范圍內,桃膠多糖與VC的總還原能力均隨濃度的增大而提高,表明桃膠具備將Fe3+還原成Fe2+形成Fe2+-TPTZ的能力,從而增強系統抗氧化能力。該作用機理可能為通過自身還原能力給出電子,破壞自由基鏈反應的電子供體,從而實現清除自由基的效果。兩者相比,VC還原能力更強。

2.4 桃膠多糖體內抗氧化作用評價

D-半乳糖衰老模型常用于抗氧化活性的藥效學評價。其中,T-AOC水平、SOD與GSH-Px活力是體內最重要的抗氧化指標,可有效清除體內自由基;MDA的含量高低能夠代表細胞膜脂過氧化的程度,間接反映組織抗氧化能力的強弱。

2.4.1 對小鼠血清中MDA含量及T-AOC、SOD、GSH-Px活性的影響 桃膠多糖對小鼠血清中MDA含量及T-AOC、SOD、GSH-Px活性的影響具體見表1。分析結果可知:與空白組相比,模型組小鼠血清中MDA含量顯著提高(P<0.05),T-AOC水平極顯著降低(P<0.01),SOD及GSH-Px活性均顯著降低(P<0.05),表明D-半乳糖可破壞小鼠的免疫系統,加速衰老;與模型組相比,VC陽性組的MDA含量顯著降低(P<0.05),T-AOC水平與SOD活性均極顯著提高(P<0.01),GSH-Px活性顯著提高(P<0.05);與模型組相比,桃膠多糖均可顯著或極顯著降低MDA含量以及提高T-AOC水平、SOD與GSH-Px活性(P<0.05或P<0.01),且隨著劑量的增加,效果變顯著。表明桃膠多糖對D-半乳糖引起致衰小鼠的SOD、GSH-Px活性具有修復作用,且提高其總抗氧化能力,可較好改善衰老小鼠的氧化應激受損情況;此外,能夠增強小鼠組織的抗氧化能力,減少細胞膜脂過氧化損傷。

表1 桃膠多糖對小鼠血清中MDA含量及T-AOC、SOD及GSH-Px活性的影響Table 1 Effects of peach gum polysaccharide on MDA content and activities of T-AOC,SOD and GSH-Px in mouse

2.4.2 對小鼠肝臟中MDA含量及T-AOC、SOD、GSH-Px活性的影響 桃膠多糖對小鼠肝臟中MDA含量及T-AOC、SOD、GSH-Px活性的影響具體見表2。分析結果可知:與空白組相比,模型組小鼠肝臟中MDA含量顯著提高(P<0.05)，T-AOC水平、SOD及GSH-Px活性均極顯著降低(P<0.01)， 表明D-半乳糖可成功建立小鼠衰老模型;與模型組相比,VC陽性組的MDA含量顯著降低、T-AOC水平及GSH-Px活性顯著提高(P<0.05),SOD活性極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,中高劑量的桃膠多糖均可顯著或極顯著降低MDA含量以及提高T-AOC水平、SOD與GSH-Px活性(P<0.05或P<0.01),且作用強弱與其濃度高低具有一定的正相關性。表明桃膠多糖能夠緩解D-半乳糖致衰小鼠模型的脂質過氧化程度,減少超氧陰離子等自由基在小鼠體內的積累,起到保護機體細胞、修復機體損傷的作用。

表2 桃膠多糖對小鼠肝臟中MDA含量及T-AOC、SOD及GSH-Px活性的影響Table 2 Effects of peach gum polysaccharide on MDA content and activities of T-AOC,SOD and GSH-Px in mouse

3 討論與結論