誘導發酵樺褐孔菌三萜類化合物合成及其抗氧化功能的研究

楊宏博,韓增華,楊 紅,李志如,韓建春,4,*

(1.東北農業大學食品科學學院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.黑龍江省科學院微生物研究所,黑龍江哈爾濱 150010; 3.黑龍江省科學院高技術研究院,黑龍江哈爾濱 150090; 4.黑龍江省綠色食品研究院,黑龍江哈爾濱 150000)

樺褐孔菌學名(Fascoporiaoblique(Pers.Fr.)Chaga)或(Inonotusobliquus(Fr.)Pilat)是一種十分珍稀且藥用價值很高的白腐真菌。其內包含如蛋白質、多糖、黃酮、三萜、甾醇等多種活性物質[1]。三萜類化合物是其中很重要的一種。主要以羊毛脂烷型三萜化合物為主,由于它的高藥用價值,被普遍應用在抗腫瘤、抗炎、抗突變、抗HIV等方面[2]。目前獲得樺褐孔菌三萜主要有三種方法,第一從天然樺褐孔菌中直接提取,但由于天然樺褐孔菌生長遲緩,三萜含量低,所以導致價格昂貴[3];第二種是采用人工栽培技術,可以實現樺褐孔菌的培育,但其在技術層面上尚不完整,產量也偏低[4];三種為液體發酵技術,此方法可以縮短生產周期、提高菌絲生長速度,保證三萜含量穩定、不受外界環境影響等優點[5]。但據文獻報道,三萜是次級代謝產物,含量較低。通過對碳氮源種類、無機鹽,生長因子,接種量、初始 pH、培養溫度、發酵時間和搖床轉速進行了優化,以及篩選菌株和優化不同提取條件進行了研究[5-7]，目前許多實驗已經證實外源誘導因子在植物和生物合成化合物方面有顯著影響[8]。

外源誘導因子的加入可以提高代謝途徑中基因的表達量與酶的活性,能改善次級代謝產物合成量,具有較強的特異性[9]。目前,不少學者研究證實單純的優化培養條件和提取工藝提高次級代謝產物的做法效果遠遠弱于加入誘導劑[10]。目前普遍應用的外源誘導因子有5種,分別為:茉莉酸甲酯(MeJA),是一種茉莉酮酸酯,同時也是一種與損傷相關的信號因子,加入到植物和真菌培養環境中,會誘導植物的化學防御,促進真菌對營養物質的吸收以及調節某些相關基因的表達[10-11]。用MeJA處理的栽培靈芝顯示靈芝酸增加1.2倍[12]。水楊酸(Salicylic acid,SA),是分布在植物體的有機酸,可以提升植物的抗逆性和特定的抗逆基因表達,來提高次級代謝產物的產量。王啟等[13]證實了SA可以影響有關三萜類化合物表達的基因,對三萜合成過程中部分關鍵酶表達程度有所提高,從而提高三萜產量。脂肪酸對細胞膜通透性有一定影響,在培養開始時加入2%的薏苡仁油,與對照相比,生物量和三萜類化合物含量分別增加了3.34倍和2.76倍[14]。金屬離子是樺褐孔菌生長必需物質,它是潛在誘導劑,并且可用于持續生產有價值的次生代謝產物[15-16]。有研究表明植物水提取物可以促進三萜化合物的積累[17]。Wang等[18]證實來自白樺樹皮的水提物(0.01 g/L)可以顯著提高類固醇產量,白樺樹皮的水提取物(0.01和0.1 g/L)可以同時進行刺激菌絲生長和類固醇含量。

目前對樺褐孔菌三萜方面的研究在提取、分離方向上較多,對如何提高三萜含量以及活性分析上鮮有報道。因此本實驗選擇 MeJA、SA、亞油酸、Fe2+、樺樹皮水提物為誘導因子,研究其對樺褐孔菌誘導的可行性,并確定最佳誘導方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌 黑龍江省微生物研究所提供;茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、水楊酸(Salicylic acid,SA)、白樺脂醇、DPPH、香草醛 Sigma公司;亞油酸 拉丁試劑有限公司;Fe2(SO4)3、無水乙醇、鹽酸 天津市匯杭化工科技有限公司。

SW-CMD超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備公司;ZPQ-400智能氣候培養箱 哈爾濱市東明醫療儀器廠;CR-21N高速低溫離心機 日立工機株式會社;UV757CRT紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司制造;DK-8D電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限責任公司;RE-52旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;SL-16超聲波水浴鍋 江蘇盛藍儀器制造有限公司;0.2 μm濾膜 美國密理博有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化及培養 將取出原始菌種在滅菌臺上鉤取1～2小塊置于準備好的斜面培養基上27 ℃下培養時間為12 d左右,待菌絲布滿試管斜面,使用自制接種針接種1.5 mm×1.5 mm大小的固態菌種,接種量為10%左右,接種在含有葡萄糖30 g/L,蛋白胨4 g/L,MgSO40.5 g/L,KH2PO41.5 g/L,CaCl20.1 g/L,VB120 mg/L液體培養基中[19],于26 ℃和150 r/min條件下振蕩培養8 d[20]。

1.2.2 菌絲體干重的測定 接種培養8 d后,用紗布過濾發酵液,用蒸餾水沖洗菌絲球數次后放于70 ℃的烘箱中,每隔2 h后取出稱重直至重量不變,此時為菌絲干重。

1.2.3 三萜類化合物的提取和測定

1.2.3.1 三萜類化合物的提取 將干燥的菌絲體用粉碎機處理,過100目篩,用10 mL異丙醇溶解0.1 g菌粉,低溫條件下超聲破壁5 min,間歇3 s后,溫度為50 ℃水浴24 h后,離心,取上層清液,補足至10 mL,制備成樺褐孔菌菌絲中三萜類化合物粗提液,在-10 ℃下保存[21]。

1.2.3.2 三萜類化合物的測定 采用香草醛-冰醋酸比色法測定三萜類物質[21],用白樺脂醇的質量為X軸,吸光值為Y軸,制作標準曲線,得回歸方程Y=0.0015X+0.0077。

準確吸取0.2 mL上述三萜類化合物粗提液,按上述1.2.3.2的方法測定,通過標準曲線得出三萜類化合物質量。

1.2.4 樺褐孔菌菌絲體中總三萜量 樺褐孔菌菌絲體中總三萜量即一批發酵培養液中所獲得的所有樺褐孔菌菌絲體中三萜類化合物的總量,計算公式如下:

總三萜(mg/L)=菌絲體干重(g/L)×三萜含量(mg/g)

1.2.5 誘導劑的添加量及添加時間的篩選

1.2.5.1 MeJA誘導三萜合成的研究 以0.2%(w/w)乙醇作為助溶劑配制濃度為10、50 和 100 μmol/L的MeJA溶液,經孔徑為0.2 μm 的濾膜過濾,在發酵第0、3、6 d將配置好的MeJA溶液加入樺褐孔菌菌絲體發酵液中,添加量為2 μL/mL,同時以空白和僅加2%乙醇的培養液為對照,在1.2.1條件下培養,發酵結束后測定樺褐孔菌干重及總三萜量。

1.2.5.2 SA誘導三萜合成的研究 配制2 mg/mL SA溶液,0.2 μm濾膜過濾。分別在發酵第0、3、6 d加入不同體積的2 mg/mL SA溶液,使SA終濃度為50、100、150 mg/L,并以加入無菌水的培養液作為對照組。在1.2.1條件下培養,發酵結束后測定樺褐孔菌干重及總三萜量。

1.2.5.3 亞油酸誘導三萜生物合成的研究 分別在發酵第0、3、6 d加入不同含量亞油酸,使亞油酸在發酵液中濃度達到0.5、1.0、1.5和2.0 g/L,在1.2.1條件下培養,發酵結束后測定樺褐孔菌干重及總三萜量。

1.2.5.4 樺樹皮水提物誘導三萜生物合成的研究 取100 g樺樹皮與1 L水一起煮沸0.5 h后,經濾紙過濾濃縮,烘干1 h,得水提物干粉,并進行高溫殺菌。在發酵第0、3、6 d向發酵液中添加水提物干粉,使其在發酵液中達到 0.01、0.1、1、5 g/L,在1.2.1條件下培養,發酵結束后測定樺褐孔菌干重及總三萜量。

1.2.5.5 金屬離子 Fe2+誘導三萜合成的研究 配制濃度為9 μmol/L硫酸亞鐵溶液后用去離子水稀釋適當倍數,在121 ℃滅菌0.5 h后在發酵第0、3、6 d加入發酵液中,使發酵液中Fe2+濃度為1、3、6、9 μmol/L;在1.2.1條件下培養,發酵結束后測定樺褐孔菌干重及總三萜量。

1.2.6 抗氧化活性的測定 將不同誘導劑誘導培養后的樺褐孔菌菌絲體經1.2.3所述方法進行提取,經過旋轉蒸發儀在45 ℃條件下濃縮之后用錫箔紙包住,將樣品在4 ℃的低溫冰箱中儲存并避光。

1.2.6.1 總還原能力的測定 參照Iris等[22]的方法,吸取不同濃度的樣品溶液1.0 mL,加入濃度為0.2 mol/L體積為2.5 mL的PBS緩沖溶液隨后再加入體積為2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液。將其放在50 ℃水浴中0.5 h,取出后加2.5 mL 10%的三氯乙酸,無渾濁時加2.5 mL蒸餾水,再加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵。反應10 min后在波長為700 nm時測吸光值為A1,空白以去離子水代替樣液為A0。以VC作為陽性對照,測定總還原能力。

總還原能力=A1-A0

1.2.6.2 DPPH· 清除能力的測定 參照Ozgen等[23]的方法,吸取2.0 mL樣品溶液,加入濃度1×10-4mol/L DPPH溶液2 mL后室溫避光反應0.5 h后在517 nm測其吸光值Ai,無水乙醇代替樣液為A0,樣液與無水乙醇混合液吸光值為Aj。

1.2.6.3 OH·清除能力的測定 參照文獻[24],吸取1.0 mL樣液加入等體積的濃度為10 mmol/L硫酸亞鐵溶液,再加入2.0 mL濃度為10 mmol/L雙氧水溶液混勻后靜置10 min后加入10 mmol/L水楊酸溶液1.0 mL后,37 ℃水浴0.5 h,冷卻后以4000 r/min離心5 min,在510 nm處測定其吸光度為Ai,去離子水代替樣液為A0,無水乙醇代替水楊酸為Aj。

1.3 數據處理

所有實驗重復n次(n≥3)表示數據方法為平均值±標準差,所有數據采用spass 20.0進行顯著性分析,P<0.05,以Origin 9.0制圖。

2 結果與分析

2.1 誘導劑篩選結果

2.1.1 MeJA誘導樺褐孔菌三萜化合物生物合成的研究 MeJA是來源與植物體內信號因子,作為外源添加劑可以改變代謝產物合成量,因此本試驗研究了MeJA溶液對樺褐孔菌菌絲體量及三萜類化合物合成的影響,試驗結果如圖1所示。

圖1 MeJA對樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.1 Effects of MeJA on the amount of mycelia and triterpenoid content of Inonotus obliquus

從圖1結果可以看出,MeJA添加濃度與時間均對樺褐孔菌菌絲體的生長及三萜類化合物的合成具有顯著影響。相同濃度下,在發酵初期加入茉莉酸甲酯菌絲含量顯著(P<0.05)低于發酵后期加入誘導劑,此結果與粗毛纖孔菌在發酵后期加入茉莉酸甲酯利于三萜化合物合成一致[26]。對于發酵時間的確定,在第6 d加入誘導劑顯著高于(P<0.05)其他組。在同一時間下,誘導劑溶液對菌絲量與三萜含量影響隨濃度的增加表現為先促進后抑制,在50 μmol/L出現峰值。從圖1可以看出,只加助溶劑會促進菌絲生長,不會增加三萜含量。在發酵期間添加MeJA時,濃度對于菌絲含量的影響呈現在0～50 μmol/L范圍菌絲含量和三萜化合物隨濃度增加而增加,當濃度在50～100 μmol/L時茉莉酸甲酯的加入會抑制菌絲的生長。但隨著濃度增加三萜含量呈現增加趨勢(P<0.05)。在第6 d加入50 μmol/L茉莉酸甲酯可得到菌絲體的量為10.05±0.01 g/L,菌絲體中三萜含量107.72±1.07 mg/g,三萜總量為1082.19 mg/L,與不加入誘導劑的對照組相比三萜總量增加了119.96%。有研究顯示,MeJA可以改善鯊烯合成酶、鯊烯環氧酶、β-香樹脂合成酶等酶的基因表達活力,同時影響酶的活性。而這些酶都在合成三萜起至關重要的作用[27]。為此后續會對MeJA在哪一時間段對哪種酶基因表達量的提高進行深入研究。三萜作為樺褐孔菌次級代謝產物的一種,MeJA的加入可能會刺激樺褐孔菌的自我保護機制,從而后期加入效果會更好一些。

2.1.2 SA誘導樺褐孔菌三萜化合物生物合成的研究 作為存在于植物體內的酸類的一種SA,它參與植物生長過程的重要活動,同時參與植物抗病害工作。SA對樺褐孔菌的誘導結果如圖2所示。

圖2 SA對樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.2 Effects of SA on the amount of mycelia and triterpenoid content of Inonotus obliquus

從圖2得出,同一時間下菌絲體量三萜含量,總三萜量三者與濃度關系表現為隨濃度增加其先增加后降低,濃度為100 mg/L時達到最大。同一濃度下,發酵早期加入SA會抑制菌絲體生長但可以促進三萜的合成。SA可改善苯丙氨酸裂解酶、H2O2酶等抗氧化酶的活力,提高基因表達量,從而實現三萜的增產同時也會在一定程度上影響菌絲含量[28]。所以從圖2中可以看出空白組的菌絲含量顯著高于其他組(P<0.05)。但三萜含量顯著低于其他組(P<0.05)。通過數據綜合分析得,SA誘導的最佳條件為濃度為100 mg/L,添加時間為第0 d,此時總三萜量為916.91 mg/L,與對照組相比提高了84.63%。

2.1.3 亞油酸誘導樺褐孔菌三萜化合物生物合成的研究 亞油酸是多碳長鏈脂肪酸,含有2個碳碳雙鍵,無毒性,可以作為外源誘導因子,而且來源廣泛。本研究初次嘗試運用亞油酸對樺褐孔菌進行誘導。

根據圖3可知,隨亞油酸濃度的增加,抑制了菌絲生長,三萜化合物含量先增加后降低。當濃度為1.5 g/L時三萜化合物含量達到最高。隨發酵添加亞油酸時間的增加,菌絲含量與三萜含量顯著高于(P<0.05)其他組,得出發酵早期加入亞油酸不利于菌絲的生長與三萜化合物的積累。過高濃度的亞油酸菌絲含量降低,可能是由于亞油酸在覆蓋在發酵液表面,降低了O2含量,從而抑制樺褐孔菌生長[29]。實驗表明,對菌絲體生長有害的條件可能對三萜類化合物的形成產生積極影響,這與先前使用亞油酸增強Inonotusobliquus多酚和黃酮類化合物產生的研究一致[9]。綜上,效果最好條件為在第6 d添加1.5 g/L亞油酸進行誘導發酵,此時總三萜量為775.58 mg/L,與對照組相比提高了56.28%。

圖3 亞油酸對樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.3 Effects of linoleic acid on the amount of mycelia and triterpenoid content of Inonotus obliquus

2.1.4 樺樹皮水提物誘導三萜化合物合成 真菌的生長所需要營養物質幾乎都從寄主體內獲得,所以將寄主樺樹皮水提物作為誘導因子加入培養液中,觀察對樺褐孔菌生長的影響,結果如圖4所示。

圖4 樺樹皮水提物對樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.4 Effects of water extract from birch bark on the amount of mycelia and triterpenoid content of Inonotus obliquus

由圖4可知,加入樺樹皮水提物對樺褐孔菌菌絲生長有顯著影響(P<0.05),隨濃度增加呈現先增加后下降的趨勢,在0～1 g/L范圍內菌絲含量與三萜化合物的含量增加,當濃度超過1 g/L后菌絲生長三萜化合物合成受到抑制。在發酵初期加入樺樹皮水提物效果明顯好于在發酵后期。當濃度為1 g/L時第0 d添加菌絲含量達到最大值10.38 g/L，三萜化合物總量比第6 d提高了16.98%。經過試驗結果表明,在發酵第0 d加入1 g/L樺樹皮水提物得到三萜化合物達到峰值,976.14 mg/L,與對照組相比提高了99.10%。由于目前對于樺樹皮水提物中所含物質尚不明確,因此后續試驗研究中進一步揭示哪種物質對發酵起作用。

2.1.5 金屬離子Fe2+誘導三萜化合物合成的研究 鐵離子對樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響如圖5所示。

由圖5可知,Fe2+對樺褐孔菌三萜類化合物的合成沒有顯著影響作用(P>0.05)。但會增加菌絲體產量,隨著Fe2+濃度的增加,對菌絲體生長呈先促進后抑制,當Fe2+添加濃度為0～6 μmol/L范圍時表現為(P<0.05),超過6 μmol/L時表現為抑制,當濃度為9 μmol/L時最低。說明Fe2+促進樺褐孔菌生長需要濃度要求[16]。而且發酵后期加入Fe2+效果弱于早期。所以,早期添加濃度為 6 μmol/L的Fe2+可使菌絲體量達到最大值,進而達到三萜增產的目的,菌絲含量達到10.44 mg/L,較對照組提高了2.04%。

圖5 Fe2+對樺褐孔菌菌絲體量及三萜量的影響Fig.5 Effect of Fe2+ on the amount of mycelium and triterpene in Birch

2.2 抗氧化活性分析

已有學者證實三萜類化合物是潛在抗氧化劑[29],為測定樺褐孔菌三萜類化合物的抗氧化能力,對經過不同誘導劑誘導后的樺褐孔菌進行了測定,本試驗測定了總還原力及多種自由基清除能力,并以VC為對照,試驗結果如圖6所示。

從圖6中數據結果中得出,樺褐孔菌產生的三萜化合物在體外抗氧化實驗中表現良好,濃度與抗氧化能力成正相關,此外,誘導因子的加入能夠有效提高抗氧化能力,但不同誘導因子對抗氧化能力的提升有一定差距。圖6(a)結果表明,經SA誘導后的效果較好,在濃度3 mg/mL其值為1.003,比未誘導樺褐孔菌三萜類化合物提高了76.02%。圖6(b)結果表明,當濃度達到2.5 mg/mL經誘導后的樺褐孔菌三萜類化合物對DPPH·清除率變化較小,但都顯著高于未誘導。經茉莉酸甲酯誘導后隨濃度增加清除率提高但不顯著(P>0.05)。圖6(c)結果表明,經誘導后的樺褐孔菌三萜化合物對于OH·清除效果明顯低于VC。經SA誘導的樺褐孔菌三萜化合物效果最好,比未誘導的提高了35.06%。

圖6 不同誘導劑對樺褐孔菌三萜類化合物的抗氧化能力影響Fig.6 Effects of different inducers on antioxidant capacity of triterpenes from Inonotus obliquus

3 結論

本研究結果表明,MeJA、SA、亞油酸、樺樹皮汁水提物和Fe2+5種誘導劑均能提高樺褐孔菌菌絲體中三萜含量,但方式略有不同。添加時間為第6 d添加濃度50 μmol/L的MeJA溶液誘導效果最為明顯,得到1082.19 mg三萜類化合物,與對照組相比提高119.96%?？寡趸芰υ囼炛?本試驗所選用的外源誘導因子都能增強樺褐孔菌三萜類化合物的抗氧化能力,其中MeJA表現突出,在其之后的為SA和樺樹皮水提物。誘導劑能提高抗氧化能力可能是由于增加了某些抗氧化官能團的含量,但詳細原因需要更深入的探究。本試驗為實現樺褐孔菌三萜類化合物的增產以及開發新的抗氧化劑資源提供科學理論基礎。