基于果實苦澀味新疆核桃資源遺傳多樣性分析

俞文君,金 強,李 根,張 銳,吳翠云,王新建,于 軍

(塔里木大學植物科學學院,南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室,新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

核桃(JuglansregiaL.)別名胡桃,為胡桃科胡桃屬喬木,溫帶樹種,位列世界四大干果之首,素有“木本油料之王”的稱號[1]。新疆產區核桃種質資源十分豐富,存在大量野生種及栽培種,且栽培地域十分廣泛[2],主要分布在塔里木盆地周邊綠洲,如和田、阿克蘇、喀什等地,產量居全國前列。在東疆吐鄯托盆地以及北疆伊犁等地,野生核桃資源也聞名于世[3]。新疆野核桃屬于國家二級保護植物,經長期自然雜交、實生繁殖,形成了后代遺傳變異程度高、品質獨特、堅果類型豐富的野生核桃種質資源庫[4]。

核桃果實除含有豐富油脂外,還有酚類化合物、多種維生素及礦質元素等。核桃仁外層,呈深淺不一淡黃色、黃色或褐色薄皮,稱為核桃內種皮[5],核桃內種皮含有大量酚類物質[6-7],尤其是含有能沉淀蛋白質、生物堿的水溶性單寧成分[8]。當單寧與口腔中唾液蛋白結合會產生收斂性,即苦澀味,從而影響口感[9],進而影響消費者對核桃的食用量或青睞程度。

目前關于核桃多酚含量及提取方法的研究已引起相關學者關注,針對新疆核桃營養成分的研究也有相關報道,研究表明多酚和單寧與苦澀味有直接關系,目前關于干果苦澀品質的研究報道還相對較少[10-14]。本文主要通過評價部分新疆核桃種質果實苦澀味的相關品質,旨在發掘部分酚類物質含量呈現極差的核桃種質材料,篩選低苦澀味核桃種質材料,為今后新疆核桃果實綜合品質遺傳改良準備中間材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃種質材料 塔里木大學園藝試驗站、溫宿縣核桃種質資源圃、溫宿縣木本糧油林場、葉城縣三個鄉鎮(加依提勒克鄉布力米吾斯塘村、江格勒斯鄉代爾瓦扎庫木村、依提木孔鄉亞勒古孜巴格村),2018年9月2日至9月10日,在樹的樹冠中部外圍,采集發育正常的完熟期果實30個,詳細情況見表 1;正己烷、甲醇、磷酸 分析純,天津市致遠化學試劑有限公司;鹽酸 分析純,四川西隴化工有限公司;硫酸鋰、鎢酸鈉、鉬酸鈉 分析純,天津市光復精細化工研究所;溴水 分析純,天津市大茂化學試劑廠;無水碳酸鈉 分析純,天津永晟精細化工有限公司;沒食子酸 分析純,天津市鼎盛鑫化工有限公司。

表1 供試核桃材料的編號、名稱及采樣地點Table 1 Number,name and sampling sites of the tested walnut material

TU-1800型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;X500R UPLC-Q-TOF液質聯用儀 美國AB公司;ODS3 C18(2.1 mm×50 mm)色譜柱 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 外觀指標測定 主要包括核桃果實單果重、縱徑、橫徑、側徑、果形指數、出仁率、殼厚度、縫合線高度,測定方法參考《農作物種質資源鑒定評價技術規范核桃》[15]。果形指數=果實縱徑/[(果實橫徑+果實側徑)/2],出仁率=果仁重/單果重×100。

1.2.2 苦澀味指標測定

1.2.2.1 兒茶素、蘆丁、香草酸、槲皮素、綠原酸、沒食子酸含量測定 核桃肉磨粉,準確稱取1.0000 g置于 15 mL 離心管中,先加入3 mL正己烷,充分振蕩1 min,10000 r/min離心,去掉上清(除去油脂),控干;之后加入4.0 mL 80%甲醇水溶液,常溫下浸泡2 h,然后超聲提取30 min 后,10000 r/min離心收集上層提取液,再加入4.0 mL 80%甲醇水溶液進行超聲提取,離心收集合并提取液,以 80%甲醇定容至 10 mL,得供試品溶液;經0.2 μm微孔濾膜過濾,備用。

采用液質聯用法(AB X500R UPLC-Q-TOF),色譜柱為島津ODS3 C18(2.1 mm×50 mm),流動相A為0.25%甲酸水,流動相B為0.25%甲酸乙腈溶液,流速為0.3 mL/min,進樣量為10 μL,柱溫為35 ℃,定性分析:本文按照多離子反應檢測(MRM)結果來確定。

表2 苦澀味分析梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure for bitterness analysis

1.2.2.2 單寧含量的測定 單寧含量的測定:分光光度法[16]。稱取果樣1 g,用80 mL水洗入100 mL容量瓶,放入沸水浴中提取30 min,取出,冷卻,定容,吸取1.0 mL提取液,分別加入5.0 mL水,1 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL碳酸鈉溶液,在765 nm波長下測定樣品溶液的吸光度?；貧w方程:y=0.2987x-0.0172,相關系數r=0.9995。

1.3 數據分析

用Excel進行數據處理和制圖,DPS進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 核桃果實外觀及苦澀味相關指標變異情況

為了解所選核桃種質資源外觀指標變異情況及苦澀味指標含量變異情況,對核桃果實外觀指標及苦澀味指標含量的平均值、標準差、變異系數、最大值、最小值和多樣性指數進行了分析,結果見表3?？梢钥闯?不同外觀指標及苦澀味指標含量的變異系數不同,外觀指標中,其中果仁重的變異系數最大為53.686%,果形指數的變異系數最小為7.501%;苦澀味指標中,其中蘆丁含量的變異系數最大為227.612%,兒茶素的變異系數最小為13.563%,從遺傳多樣性指數來看,外觀指標中,多樣性指數的范圍在0.015～2.123,平均多樣性指數為0.449?？酀吨笜酥?多樣性指數變動范圍在 0.015～171.81之間,平均多樣性指數為 25.065,蘆丁的變異系數較高,但單寧的多樣性指數較高。

表3 核桃果實外觀及苦澀味品質性狀變異比較(n=38)Table 3 Comparison of walnut fruit appearance and bitter taste quality character variation(n=38)

可見變異系數和遺傳多樣性在核桃果實外觀及顯苦澀味指標上表現得并不一致,說明核桃果實中蘆丁變異性廣泛,但其分布均勻度較低,果實中單寧含量變異程度較小,但其遺傳豐富度較高。

2.2 核桃果實苦澀味指標的相關性

對核桃果實中苦澀味指標進行相關性分析(表4),結果表明,槲皮素與蘆丁呈極顯著正相關(P<0.01)相關性高達 73%,隨著槲皮素含量增加蘆丁含量增加;沒食子酸與兒茶素、槲皮素呈顯著性正相關(P<0.05),說明隨著沒食子酸含量增加兒茶素與槲皮素含量也隨之增加;沒食子酸與香草酸呈顯著性負相關(P<0.05),說明隨著沒食子酸含量增加香草酸含量降低;單寧與兒茶素、沒食子酸呈極顯著正相關(P<0.01),說明隨著單寧含量增加兒茶素與沒食子酸含量隨之增加。

表4 核桃果實中顯苦澀味指標含量的相關性分析Table 4 Correlation analysis of bitter taste in walnut fruit

2.3 核桃果實苦澀味指標主成分分析

對38個核桃品種的7個苦澀味指標進行主成分分析,從表5可以看出,4個主成分的累積方差貢獻率為 83.58%,基本包括了苦澀味指標的所有具有的信息,可將原來的7個苦澀味指標轉化成4個主成分,第1主成分的特征值為2.4168,方差貢獻率為34.53%,代表7個苦澀味指標的34.53%的信息;第2主成分的特征值為1.4749,方差貢獻率為21.07%,方差累計貢獻率為55.60%,第3主成分的特征值為1.1028,貢獻率為15.75%，累計貢獻率71.35%;第4主成分的特征值為0.8561,方差貢獻率為12.23%,累計貢獻率為83.58%。由表5可知,在第1 主成分主要是蘆丁、槲皮素、沒食子酸及單寧對苦澀味的貢獻大;在第2主成分中起作用的蘆丁、槲皮素,其中兒茶素、沒食子酸、單寧為負值,說明兒茶素、沒食子酸、單寧與第二主成分的影響為負相關;在第3主成分中起作用的為香草酸,綠原酸為負值,說明綠原酸對第三主成分的影響為負;在第4主成分中起作用的為香草酸和綠原酸。從主成分分析的結果可以看出核桃果肉中兒茶素、蘆丁沒食子酸等指標基本囊括了核桃苦澀味指標信息。

表5 核桃果實苦澀味指標含量主成分分析Table 5 Principal component analysis of bitter taste index content of walnut fruit

表6 38個核桃種質材料苦澀味指標均值Table 6 Mean bitter taste index of 38 walnut germplasm materials

2.4 核桃果實外觀及苦澀味指標聚類分析

由圖1可知,根據核桃外觀指標及苦澀味指標含量,對38份核桃種質進行系統聚類(歐式距離,類平均法),在距離1197左右處,可將核桃種質分為4類,第Ⅲ類包含的核桃種質資源最多,有20 份資源,其次是第Ⅰ類有 16 份資源,第Ⅱ類和第Ⅳ類最少,僅一份資源為加州黑核桃1和南6-4。第Ⅰ類 16 份資源中,包括加州黑核桃2、3、4、5、7、8及中寧魁、中寧魁大、中寧行16、元丹等10份砧木用種質資源,中4-12,中3-16也在其中。第Ⅱ類中僅有 1 份加州黑核桃1,第Ⅲ類包括南半1-22、葉城150年、葉城170年等主要為常規栽培品種及其實生后代,第Ⅳ類中也僅有1份南6-4核桃自然實生后代種質,其單寧含量最高。

圖1 核桃果實外觀及顯苦澀味指標含量聚類Fig.1 Cluster of the appearance and the component of bitter and astringent taste in walnut fruit

3 討論與結論

澀味是口腔上皮細胞暴露在明礬或單寧溶液中,產生一種干燥、收斂、粗糙的復合感覺[17]。食品中未成熟的果實、堅果、茶及紅酒等均具有澀感,具有澀味的化學物質主要有明礬類與多酚類[18]。

苦澀味來源于多酚類物質,高麗萍教授課題組研究證明,茶葉中多酚類物質主要是兒茶素,兒茶素分為單體兒茶素和酯型兒茶素,其中酯型兒茶素約占 70%,是影響茶葉苦澀味的主要成分[18]。2003年德國學者Scharbert等[19-20]發現酯型兒茶素是綠茶苦澀味的主體,苦味物質主要為咖啡堿和EGCG,蘆丁(茶葉中的黃酮苷)自身沒有明顯的滋味,但有增強咖啡堿苦味的作用。茶葉的苦味成分主要包括生物堿、氨基酸、茶皂素、多酚類物質,其中黃烷醇類,黃烷酮類、黃酮醇類、花色素類等多酚類物質同時具有苦味和澀味[21]。乜蘭春等[22]研究蘋果果實酚類物質時發現綠原酸、兒茶素、表兒茶素和原花青素是引起蘋果果實澀感的主要物質。

果實中的苦澀味物質經常影響其食用和加工品質,是果實風味的重要指標之一,引起果實澀味的主要物質也是單寧以及其他少數幾種酚類物質,澀味物質有時可以增加果實口感,當澀味物質含量過多時,就會引起消費者的不適應[23-24]。新疆主要栽培核桃品種整體口感品質多年來很受各地經銷商和消費者青睞,尤其以‘新溫81’、‘新新2’、‘新溫185’等品種為代表品種[25]。但是隨著核桃栽培面積在全國各地不斷擴大[26],核桃的消費量仍然沒有明顯上升,價格也呈一定下降趨勢。雖然核桃果實富含多種保健營養成分,消費者人均消費核桃量還不是很多[27]。究其原由,主要受到了核桃果實所含苦澀味物質的影響,造成人們每次食用數量不多。

本研究結果顯示,核桃果實品質性狀變異豐富,表現出不同程度的遺傳多樣性。外觀指標中果仁重、縫合線高度、出仁率的變異系數較大;顯苦澀味指標中蘆丁、槲皮素、香草酸的變異系數較大。外觀指標中單果重、果仁重、平均三徑的多樣性指數較大;顯苦澀味指標中單寧、綠原酸、沒食子酸、兒茶素的多樣性指數較大,充分反映了這些性狀的遺傳多樣性及豐富程度,具有較為豐富的遺傳信息和利用潛力。外觀指標中果形指數變異系數較低,苦澀味指標中兒茶素的變異系數較低,反映其離散程度較低,性狀遺傳穩定。對來源不同的新疆核桃種質進行對比分析可知,砧木類型其苦澀味含量較低,栽培品種外觀品質較優良。自然實生后代中發現南6-4單寧含量最高,而且綜合聚類分析結果顯示南6-4的遺傳基礎深厚、進化程度較低,該材料可能含有較多其它優良性狀,可作為今后本地核桃砧木品質改良和新品種選育的親本或中間材料。

基于苦澀味物質和綜合外觀的多樣性聚類分析發現,引進加州黑核桃主要和部分取自溫宿縣核桃林場、溫宿縣核桃資源圃以及溫宿縣核桃林場的幾個“中寧”品種及新疆本地自然實生后代核桃種質聚在一類,表明在苦澀物質成分方面,加州黑核桃和新疆本地核桃有相似之處。經該研究探索,發現苦澀品質方面,新疆阿克蘇當地主栽品種比幾個引進加州黑核桃和“中寧”核桃品種高,且變異幅度較大,為今后對新疆當地核桃種質苦澀味品質遺傳改良工作鋪墊了較好的種質材料空間,也為新疆當地核桃種質苦澀品質優化提供了可能性。