基于NIR高光譜技術快速預測冷鮮雞肉熱殺索絲菌含量

何鴻舉,蔣圣啟,馬漢軍,2,王 慧,陳復生,康壯麗,潘潤淑,朱明明,趙圣明,王正榮

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003; 2.河南科技學院博士后研發基地,河南新鄉 453003; 3.河南工業大學糧油食品學院,河南鄭州450001)

我國眾多肉類食品中,雞肉占據重要地位,現已成為百姓餐桌上的主要食品之一[1]。因含有多種營養素、肉質細嫩且更易被人體消化吸收,雞肉逐漸成為我國居民的主要選擇之一[2-3]。據統計,目前我國雞肉消費量占到總禽肉消費量的90%以上,且在未來幾年雞肉的消費量還有逐年增加的趨勢[4]。目前市場上流通的雞肉主要有熱鮮肉、冷鮮肉和冷凍肉[5]。隨著我國居民生活水平的不斷提高,消費者的雞肉消費理念也在逐漸改變,冷鮮雞肉因能夠最大限度地保持其質地柔軟、彈性好、口感鮮美和營養價值,在我國大中城市已成為生鮮肉消費的主流。然而,冷鮮雞肉在冷藏過程中由于水分含量多、營養物質豐富,容易受到一些嗜冷菌如熱死環絲菌、假單胞菌、腸桿菌、乳酸菌、莫拉氏菌和不動桿菌等的污染而引發肉品腐敗變質,從而導致其品質下降,是新鮮度降低的最主要原因。熱殺索絲菌屬于兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌,它在低氧和4 ℃的條件下能較快的生長繁殖,因此是引起冷卻肉腐敗的主要微生物[6-7]。熱殺索絲菌占冷卻雞肉初始菌相的13.3%,在0～4 ℃冷藏溫度下導致冷藏雞肉和雞肉制品腐敗變質的主要腐敗菌之一[8-9]。Li等[10]研究發現,熱殺索絲菌還是冷卻豬肉托盤包裝后導致其腐敗變質的主要微生物。國外學者Leroi等[11]和Russo等[12]已經將熱殺索絲菌的某一特定菌株建立了生長預測模型。國內學者高磊等[13]對冷卻雞肉中熱殺索絲菌進行了分離、鑒定并對致腐能力進行了評價。劉超群等[14]建立并且驗證了冷鮮豬肉中熱殺索絲菌生長動力預測模型,判定系數R2的值達到了0.99 以上。及時準確檢測熱殺索絲菌,有針對性地對其加以控制,可促進肉品新鮮度,對延長貨架期具有直接意義。目前,熱殺索絲菌檢測常用的方法有平板計數法,分子生物學法,免疫學法等,盡管這些方法結果可靠,但都存在操作繁瑣、需要破壞原材料、檢測時間長、效率低下、難實現批量檢測等缺點。隨著冷鮮肉消費量的不斷增加,以及消費者對新鮮肉品的強烈需求,迫切需要研發新技術以實現對冷鮮雞肉熱殺索絲菌的快速無損檢測。

高光譜成像技術(Hyperspectral imaging,HSI)作為一種新興的無損檢測技術,近年來在食品品質方面的研究備受關注。與傳統的光譜技術相比,HSI技術具有高分辨率,其光譜精度可達2～3 nm,不僅能反應樣品光譜信息的細微變化,還可提供更多與試驗樣品相關的信息[15]。目前,HSI技術在雞肉微生物方面的研究已有報道,如Feng和Ye等[16-17]分別采用HSI快速預測新鮮雞肉的總細菌含量(TVC),經光譜數據分析,可得雞肉TVC的預測相關系數分別為0.96和0.83;Feng等[18]采用近紅外HSI對雞肉中的腸桿菌科進行了研究,其所得雞肉腸桿菌科預測模型的相關系數為0.93,其結果較好。然而,作為冷鮮雞肉儲藏過程中的主要腐敗菌之一的熱殺索絲菌[19-20],目前采用近紅外高光譜技術對其在雞肉中檢測的相關報道較少,故本實驗以冷鮮雞肉為研究對象并基于高光譜成像技術的快速優勢,通過挖掘光譜數據和冷鮮雞肉中熱殺索絲菌之間的內在相關性,構建一種快速定量檢測熱殺索絲菌的方法,為改善甚至將來代替常規檢測手段提供數據支撐和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮雞胸肉 河南眾品食業股份有限公司;CM881熱殺索絲菌培養基 英國Oxoid公司;CM0509緩沖蛋白胨水 英國Oxoid公司;80% NaCl溶液 實驗室現配;無菌蒸餾水 實驗室自制;超純水 實驗室自制。

HSI-eNIR-XC130型推掃式高光譜成像系統 臺灣五鈴光電科技有限公司;The Unscrambler 9.7建模軟件 挪威CAMO公司;Matlab程序開發軟件包 美國Mathworks公司;20040081型Haier冰箱 中國海爾公司;SW-CJ-1D雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;DHP-9902恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;KQ-100DB型數控超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司;VORTEX-6振蕩器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;WT5003CH型玻璃罩精密天平 常州萬泰天平儀器有限公司;Ultra class UV plus超純水儀 德國SG公司;HV-85全自動高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;BF240微生物培養箱 德國Binder公司;Scientz-04拍打式均質機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預處理 由河南眾品食業股份有限公司提供的新鮮的雞胸肉(長度(16±1.5) cm,寬度(11±1.5) cm)置于冷藏箱內運至食品學院肉品實驗室,剔除表面肌膜并將整塊雞胸肉分割成3.0 cm×3.0 cm×1.0 cm(長×寬×高)的小塊(約10 g),共獲得127塊樣品;將樣品分裝7份至一次性帶蓋的塑料盒內并貼上標簽,置于4 ℃的冰箱內,分別儲藏1、2、3、4、5、6、7 d,每天取出若干樣本,進行光譜數據的采集及樣品中熱殺索絲菌含量的測定。

1.2.2 高光譜數據采集 光譜數據采集之前,需從4 ℃冰箱內取若干待測樣品,并將其置于室溫下待其恢復至室溫,同時將高光譜成像系統的光源提前打開進行預熱,待其穩定后方可對參數進行設置,即曝光時間為4.65 ms,掃描速度為6.54 mm/s時儀器狀態最佳。具體高光譜設置參數方法參考王慧等[21]研究。為降低相機暗電流和室內照明對樣品圖像采集過程中所帶來的影響,需對原始圖像進行黑白校正,故先采集黑白板的圖像后,方可對樣品進行掃描試驗,其檢測波長范圍為900～1699 nm。按如下公式進行校正[21]:

式(1)

式中,R-校正后的圖像;R0-原始高光譜圖像;RB-黑板圖像,其反射率為0%;RW-白板圖像,其反射率為99.9%。

1.2.3 熱殺索絲菌的檢測 高光譜圖像采集完畢后,立即測定肉樣中的熱殺索絲菌菌落總數。利用平板培養法測定[22],具體操作為:將每個10 g樣品置于無菌袋中,加入90 mL蛋白胨緩沖液(0.1%蛋白胨+0.85% NaCl),使用拍打式均質機將樣品與緩沖液混合均勻,獲得熱殺索絲菌懸液,然后梯度稀釋,依次取1 mL菌懸液加入9 mL蛋白胨緩沖液。最后取0.1 mL菌懸液涂在熱殺索絲菌培養基平板上,然后將平板倒置,于25 ℃下培養48 h后,取出,選擇菌落數在30～300個之間的平板,取其對數值(lg CFU/g)計數。本研究中記錄的標準數據為每g冷鮮雞胸肉中所含的熱殺索絲菌。

1.2.4 光譜提取及預處理 高光譜成像系統在光譜信息采集的過程中會受到儀器自身噪聲以及外界環境的影響,因此獲取的光譜數據信息中既含有樣本本身的信息,同時還包含一些無關樣本的噪聲信息等。這些無關信息的存在會對模型構建產生很大的影響。因此,需要對原始光譜數據進行預處理,以減少外界環境以及系統噪聲的影響,從而獲取高性價比的光譜數據,以提高預測模型的精度和穩健性。本試驗主要使用多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction,MSC)、基線校正(Baseline Correction,BC)和標準正態變量校正(Standard Normal Variable Correction,SNV)三種方法對原始光譜數據進行預處理。其中,MSC法是對每一條光譜的散射進行校正,以獲取較理想的光譜信息[23-24];BC法可以明顯抑制基線漂移的現象,并改善信號質量[25];SNV法的基本原理是將每條光譜的波長點反射吸光度值看作正態分布,并將原始光譜吸光度值減去該光譜平均吸光度值,最后除去該光譜吸光度值的標準偏差[26-27]。

1.2.5 模型的構建及評價 偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)算法是由伍德和阿巴諾等在1983年首次提出的一種新型多元數據分析方法,它是通過最小化誤差的平方和找到一組數據的最佳函數匹配,用最簡的方法求得一些絕對不可知的真值,而令誤差平方之和為最小。本試驗中將熱殺索絲菌參考值作為因變量,將全波段的波長作為自變量,通過PLS回歸算法來構建預測冷鮮雞肉中熱殺索絲菌含量的PLS預測模型。

PLS模型效果評價使用相關系數(R)、校正誤差(Root Mean Square Error of Calibration,RMSEC)、內部交叉驗證均方根誤差(Root Mean Square Error of Cross Validation,RMSECV)和外部預測均方根誤差(Root Mean Square Error of Prediction,RMSEP)等指標[28]。其中用R與1的接近程度來表示模型的精度,用RMSEC、RMSECV、RMSEP與0的接近程度來反映模型的穩定性[29]。

1.2.6 最優波長的選擇與模型優化 本試驗中獲得的全波段光譜在900～1699 nm波長范圍內,其中包含485個波長,若采用這485個波長作為建模的輸入變量,則存在大量的冗余信息,需采用合適方法選取最優波長,剔除無用信息以減少數據計算量,從而提高模型的構建效率和精度。本試驗采用PLS-β系數法和逐步回歸法(Stepwise)篩選最優波長。PLS-β法是在高光譜領域應用最為廣泛的一種特征波長提取方法,來源于PLS建模過程[30]。Stepwise是多元線性回歸法中選擇特征波長的一種常用數學方法,即利用逐步回歸法按一定顯著水平篩選出統計檢驗顯著的波長。續投影算法(Successive Projections Algorithm,SPA)是一種逐步循環的變量選擇方法,可以將有效的信息從大量的光譜數據中篩選出來,找到光譜變量之間共線性最小的特征波長,優化建模條件[31]。將獲取的特征波長作為輸入變量,進行全波段PLS回歸模型(F-PLS)優化,建立最優波長PLS模型。此外,當輸入變量個數小于樣本個數時,還可使用多元線性回歸(Multiple Linear Regression,MLR)法建立預測建模[32]。將經PLS-β、Stepwise和SPA三種方法所提取的特征波長優化F-PLS模型,并比較所建預測模型的精度和性能。

1.3 數據處理

PLS-β法在軟件Unscrambler 9.7中進行,Stepwise和SPA操作在MATLAB2016a中進行,而模型構建使用化學計量學軟件Unscrambler 9.7完成。

2 結果與分析

2.1 熱殺索絲菌含量

實驗樣品的熱殺索絲菌的測量結果如表1所示。將所有樣品的測量值依照從小到大排序,按每四個樣品中隨機取一個樣品(1/4)選入預測集,剩余樣品(3/4)選入校正集。

表1 雞肉熱殺索絲菌測量值的統計結果Table 1 Statistical results of Brochothrix thermosphacta values in chicken

2.2 雞肉樣品光譜特征

使用HSI-eNIR-XC130型推掃式高光譜成像系統自帶軟件HSI Analyzer軟件進行高光譜圖像校正和光譜信息提取。利用HSI Analyzer軟件選取感興趣區(Region of interest,ROI),感興趣區域的大小為3 cm×3 cm,像素為640×417。然后求得感興趣區域內所有像素點的平均光譜數據。為了綜合反映每塊樣品整體信息從而減小誤差,將樣本的平均光譜曲線作為光譜曲線。最終得到127 樣品×485波長的原始平均光譜數據集合。然后進行三種預處理,127個樣品原始光譜特征及三種預處理平均光譜特征如圖1所示。

圖1 冷鮮雞肉的近紅外光譜特征Fig.1 NIR spectroscopic characteristics of the fresh chicken samples注:a:原始光譜,b:MSC光譜,c:BC光譜,d:SNV光譜。

從圖1可得,不管是原始光譜還是預處理光譜,不同樣品的光譜曲線總體趨勢一致,但每個樣本的光譜曲線有高低之分,這是由于雞肉品樣本的化學成分含量不同導致的,近紅外光譜出現吸收峰是源于雞肉中化學組分中的各種含氫基團(包括O-H、N-H、C-H等)發生伸縮、彎曲等運動的合頻吸收[33]。雖然光譜上沒有明顯的熱殺索絲菌吸收峰,但是熱殺索絲菌的生長離不開雞肉中的各種化學組分,可以通過化學計量學手段挖掘光譜信息,尋找到特征光譜信息與熱殺索絲菌之間的定量關系。

2.3 基于全波段光譜的F-PLS模型預測熱殺索絲菌

本實驗基于三種不同預處理全波段485個波長,采用PLS回歸算法來挖掘雞肉熱殺索絲菌的含量與光譜信息之間的相關性。結果如表2所示。

表2 雞肉熱殺索絲菌F-PLS回歸預測結果Table 2 F-PLS performance for predicting Brochothrix thermosphacta values in chicken

由表2得知,用預處理光譜構建的3種F-PLS回歸模型預測冷鮮雞肉熱殺索絲菌的效果良好,相關系數相近(RC、RCV和RP),均接近于1.0,誤差也較小(RMSEC、RMSECV和RMSEP)。其中,經BC預處理的F-PLS模型相關系數(RC=0.984、RCV=0.960、RP=0.973)均高于其他兩種預處理,且誤差(RMSEC=0.208 lg CFU/g、RMSECV=0.330 lg CFU/g、RMSEP=0.295 lg CFU/g)均低于其他兩種預處理,故BC預處理的光譜所構建的熱殺索絲菌的F-PLS回歸模型的性能和穩定性最優。此外,對比三種不同預處理F-PLS模型的校正集RMSEC與驗證集RMSEP絕對值差ΔE可知,BC預處理的光譜所構建的熱殺索絲菌的F-PLS回歸模型的ΔE最小,為0.087 lg CFU/g,這說明了在三種預處理的光譜所構建的PLS回歸模型中,BC預處理的光譜所構建的F-PLS模型具有最好的魯棒性。故以下數據的進一步處理均采用BC預處理的光譜進行操作。

2.4 最優波長提取

采用PLS-β法、Stepwise和SPA算法從BC預處理全波段光譜中篩選出最優波長,以減少數據運算量、提高建模效率,本試驗使用The Unscrambler 9.7和MATLAB 2016a兩個軟件對最優波長進行提取,其提取結果如表3所示:

表3 特征波長提取結果Table 3 Results of optimal wavelengths selected from BC spectra

由表3得知,通過PLS-β、Stepwise和SPA三種方法篩選出特征波長的個數均不同,且都在40個以下。波長減少量都達到了90%以上。PLS-β、Stepwise和SPA三種方法篩選出最優波長的個數分別為25、32個和27個。其中PLS-β法所提取的波長數最少,相比較于全波段485個波長,波長減少量最高,達到了94.8%。PLS-β篩選出 25個特征波長分別為900.6、905.5、908.8、930.2、933.5、951.6、1017.4、1025.7、1086.5、1124.4、1167.1、1183.6、1213.2、1265.9、1336.6、1364.6、1376.2、1389.4、1405.8、1428.9、1499.9、1523.0、1673.5、1688.5和1695.1 nm,具體位置如圖2 所示。

圖2 BC預處理光譜中系數法篩選出的最優波長具體位置Fig.2 Specific location of the optimal wavelengths selected by PLS-β from the BC pretreatment spectra

2.5 基于最優波長的F-PLS模型優化

基于PLS-β、Stepwise和SPA分別篩選出的特征波長作為輸入變量,熱殺索絲菌參考值為因變量重新運算,優化F-PLS回歸模型和建立MLR預測模型,結果如表4所示。

由表4可得,表4中所建立的6種雞肉熱殺索絲菌的預測模型的相關系數R值均高于0.8,且均方根誤差均較小。其中通過PLS-β和Stepwise篩選出的最優波長所構建的PLS-β-PLS、PLS-β-MLR、S-PLS和S-MLR四種預測模型相關系數R值均高于0.89。而基于SPA法篩選的最優波長所建的SPA-PLS 和SPA-MLR預測模型的相關系數均小于0.9。綜合考慮最優波長個數和模型相關系數以及魯棒性。其中基于PLS-β法篩選的最優波長所建PLS-β-PLS模型的波長數量最少(25個),RP最高且RMSEP最低,RMSEC與RMSEP 絕對值差次最小,此模型的運算效率、預測性能和穩定性均優于其他5種模型。最優模型預測結果如圖3所示。

3 結論

采用近紅外(900～1699) nm高光譜成像技術對不同冷藏時期雞胸熱殺索絲菌含量進行快速無損檢測研究?；谌N不同預處理光譜信息(MSC、SNV、BC),構建全波段F-PLS模型來預測雞肉熱殺索絲菌含量,均取得了較好的效果。其中采用PLS-β法和Stepwise算法來篩選特征波長分別建立優化的PLS和MLR模型,結果顯示基于PLS-β法中篩選的25個特征波長構建的PLS-β-PLS模型預測效果較好。故近紅外高光譜成像技術結合PLS-β法建立預測模型可潛在實現對雞肉熱殺索絲菌含量的快速預測。此外,本研究仍有不足之處,下一步工作將增加建模樣本數量,擴大檢測范圍,進一步提高模型的精度和穩定性。同時,也將在雞肉中熱殺索絲菌的可視化分布方面進行深入研究。