高效液相色譜法測定哈密大棗干制過程中6種有機酸的含量變化

關尚瑋,陳 愷,萬紅艷,劉慧麗,范利君,王雪妃,李煥榮

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

棗(ZiziphusjujubeMill)鼠李科(Rhamnaceae)木本植物。大棗中含有豐富的黃酮類、有機酸、糖類、維生素和礦物質元素等物質,有很高的保健作用和藥用價值[1]。紅棗除少部分鮮食外,大量被制成干棗制品進行銷售[2],目前大棗的干制方式主要分為自然干制和熱風干制[3],大棗熱風干燥是一種高效、流行的果實保鮮和深加工方法[4]。不同的干制方式對大棗的營養價值有很大的影響。有機酸作為棗果中重要的風味指標之一,對果實的營養價值有著重要的作用[5]。大棗中的酸類物質可以起到免疫調節作用,提高大鼠的免疫應答,降低自身體內的低抗體應答[6]。大棗在不斷地發育過程中,三羧酸循環(TCAC)及糖異生作用在不斷地消耗有機酸,使有機酸在果實內部逐漸代謝。大棗加工制品中,有機酸的含量在不同的處理方法中逐步地發生變化,從而影響大棗的品質[7]。

目前有機酸常見的測定方法有滴定法、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)[8-12]等,其中氣相色譜法不適用于不揮發性物質和對熱敏感性物質,且前處理比較繁瑣[13]。高效液相色譜法因高效快速、靈敏度較高、穩定性好在有機酸含量的測定與分析過程中被廣泛地使用[14-17]。高效液相色譜法用于分析大棗在干制過程中有機酸的含量變化研究較少,大多集中在生長發育期間以及干制過后產品的測定[18-22]。王向紅等[23]利用HPLC測定不同種類的棗果中齊墩果酸和熊果酸的含量并進行分析,發現酸棗中有機酸的含量明顯高于其它大棗中的酸含量。劉禎妍等[24]使用高效液相色譜法對‘駿棗’的果實、葉片在生長過程中有機酸的變化趨勢進行了探究,發現駿棗中主要以蘋果酸、檸檬酸為主,果實與葉片中酸的總含量變化趨勢相同。但是,關于哈密大棗中有機酸含量變化方面的研究少有報道[25-26]?；谇捌趯嶒炑芯炕A,45 ℃熱風干制[27]條件,哈密大棗有較好的果型指數與細胞結構。

本研究以脆熟全紅期的哈密大棗作為實驗材料,采用自然曬干與45 ℃熱風干制處理,對哈密大棗干燥過程中6種有機酸的含量進行定性和定量分析,探究哈密大棗在自然曬干與熱風干制過程中有機酸含量的變化規律,為哈密大棗果實品質的研究提供理論依據,從而更好地控制大棗在生產過程中產品的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

哈密大棗 均產自新疆哈密;95%乙醇、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸等 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸標準品、甲醇(色譜純)等 上海源葉生物科技有限公司;實驗用水 超純水。

HPLC(LC-20A)高效液相色譜儀 日本島津公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海市一恒科技有限公司;Q-250DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;HP-01循環水式多用真空泵 天津市恒奧科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 自然曬干:晾曬場地系烏魯木齊新疆農業大學工科樓,平均日照12 h,晾曬期間最高溫度27 ℃,最低氣溫7 ℃。將脆熟全紅期哈密大棗30 kg平鋪于涼席上,放置于天臺空地進行晾曬,含水量控制在25%左右停止晾曬,在自然曬干過程中每隔2 d取一次樣,每次取樣250 g,測定大棗中有機酸的含量。

熱風干制:干燥箱升溫至45 ℃時,將哈密大棗鋪平放置于電熱恒溫鼓風干燥箱內進行熱風干制,在熱風干制過程中每隔4 h取一次樣,每次取樣250 g,當大棗的水分含量控制在25%左右時干制結束,測定項目同上。

1.2.2 有機酸測定方法的建立 色譜條件:WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)進行分離，流動相為一定濃度的KH2PO4緩沖溶液∶甲醇=9∶1；調節到一定pH；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

1.2.2.1 色譜條件的優化 檢測波長的選擇:分別對6種有機酸在190～400 nm進行全波長掃描,比較各有機酸在不同波長處的最大吸收峰。

流動相濃度的選擇:將流速調整為0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量為20 μL,磷酸鹽緩沖溶液的濃度分別調整為0.01、0.05、0.1 mol/L?？疾觳煌瑵舛鹊牧鲃酉鄬Ω饔袡C酸保留時間的影響。

流動相pH的選擇:流速調整為0.8 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量為20 μL,固定磷酸鹽的濃度不變為0.05 mol/L,用1.0 mol/L的磷酸調節pH,考察不同pH(2.1、2.3、2.5、2.7、2.9)條件下各有機酸的分離情況。

1.2.2.2 有機酸標準溶液的制備 精確稱取適量的草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸標準品,用超純水超聲溶解,分別制成15 mg/mL的標準溶液。

1.2.2.3 有機酸標準曲線的繪制 精確吸取草酸溶液1 mL,酒石酸、檸檬酸、琥珀酸溶液各10 mL,蘋果酸溶液1 mL,富馬酸溶液1 mL,加入超純水配制成草酸溶液0.5 mg/mL、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸溶液1 mg/mL、蘋果酸溶液3 mg/mL、富馬酸0.1 mg/mL的有機酸混合標準品溶液,分別過0.22 μm微孔濾膜待測。連續6次進樣,并進行測定。以有機酸混合標準品溶液的濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,對結果進行線性回歸分析,得到標準曲線。

1.2.2.4 樣品處理 參照張麗麗等[28-30]的方法并進行改進,準確稱量棗果5.00 g,加入適量超純水,置于預冷的研缽內,將研缽放置于冰塊上研磨至勻漿,使用15 mL超純水進行多次沖洗研缽并轉至25 mL離心管中,超聲提取20 min后,將離心管轉至4 ℃ 15000 r/min離心20 min,過濾,收集濾液,采用超純水定容至10 mL容量瓶中,通過0.22 μm濾膜過濾后,置于樣品瓶中進行上機測定。

1.3 數據處理

在Lab Solution工作站,色譜圖中各峰的峰面積與其保留時間對得到的物質進行定量與定性分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 檢測波長的選擇 分別對6種有機酸在190～400 nm進行全波長掃描,發現各種有機酸在210 nm波長處均有較大的吸收峰,故采用210 nm作為檢測波長。

2.1.2 流動相濃度的選擇 磷酸鹽緩沖液濃度的高低影響酸存在形式的穩定性,從而影響分離效果。將流動相配制成不同濃度的溶液,研究流動相濃度對各酸保留時間的影響。結果見圖1。由圖1可知,當流動相的濃度為0.05 mol/L時,各物質的分離度較好。隨著流動相濃度的繼續增加,其分離效果稍有增強。但由于高濃度的鹽會對泵和柱子的壽命產生影響,因此選擇0.05 mol/L的KH2PO4溶液進行后續實驗。

圖1 流動相濃度對保留時間的影響Fig.1 Effect of mobile phase concentration on retention time

2.1.3 流動相pH的選擇 通過調節流動相的pH,可以達到抑制有機酸在水溶液中解離的作用。將流動相調成不同pH,按照同樣的色譜條件,得到流動相pH對有機酸保留時間的影響,結果見圖2。由圖2可知,改變流動相的pH對草酸以及蘋果酸的保留時間影響最大,但pH的降低會增加色譜柱的損傷,當流動相的pH為2.3時,各物質的保留時間以及分離度較好,所以選用流動相的pH為2.3進行后續實驗。

圖2 流動相pH對保留時間的影響Fig.2 Effect of mobile phase pH on retention time

2.2 有機酸標準曲線的建立

由表1可知,6種有機酸在0.0005～3 mg/mL線性范圍內,決定系數(R2)在0.9991～0.9996之間,表明6種有機酸的相關性良好,檢出限范圍在0.0002～0.0005 mg/mL之間,定量限范圍在0.0008～0.0098 mg/mL,在此條件下可測定大棗中的有機酸含量。

表1 有機酸標準曲線的線性參數Table 1 Linear parameters of standard curve of organic acid

2.3 HPLC圖譜分析

有機酸混合標準品的高效液相色譜圖見圖3。從圖3得出,6種有機酸標準品達到基線分離。精確吸取哈密大棗溶液20 μL進樣,結果見圖4。圖4表明,哈密大棗溶液中含有5種有機酸,且分離度較好,琥珀酸未檢出。

圖3 有機酸混標準品的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography of organic acid mixed reference

圖4 哈密大棗有機酸高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatography of organic acids in hami jujube

2.4 精密度檢測結果

準確吸取稀釋后的有機酸標準溶液20 μL,連續進樣6次,分別計算其精密度。由表2可知,各混合標準溶液的相對標準偏差(RSD)在0.99%～4.00%之間,表明該方法的精密度達到分析要求。

表2 測定方法的精密度Table 2 Precision of the method

2.5 重復性試驗結果

精密稱取哈密大棗樣品6份,按1.2.2.4方法制備樣品溶液,按照上述色譜條件進樣20 μL,重復進樣6次,并計算其相對標準偏差。由表3得出,6次實驗的RSD均在0.45%～4.11%之間,表明該方法重現性良好。

表3 測定方法的重復性Table 3 Repeatability of the method

2.6 回收率結果

準確稱取哈密大棗5.0 g,按照按1.2.2.4方法制備樣品提取液,準備同一樣品提取液6份,將不同質量濃度的各種有機酸標樣加入至每份提取液中,充分混勻后,經0.22 μm濾膜過濾后進樣檢測,平行測定6次,根據加入的標準品質量濃度與檢出的質量濃度計算回收率,結果見表4。由表4可知,各有機酸的回收率在95.96%～104.35%范圍之間,說明此方法在測定過程中的回收率良好,精確度較高。

表4 有機酸加標回收率Table 4 Standard recovery rate of organic acids

2.7 哈密大棗有機酸含量測定結果

由圖5得出,自然曬干整個過程中,5種有機酸含量呈先下降后上升的趨勢,且在干制初期變化明顯,琥珀酸未檢出。

圖5 自然曬干過程中有機酸含量變化Fig.5 Changes of organic acid content in natural drying process注:不同字母表示差異顯著(P<0.05);圖6同。

在干制初期,隨著干制時間的延長,大棗中的有機酸參與三羧酸循環的量逐漸增加,有機酸在不斷的代謝過程中逐漸轉變為糖,致使酸含量不斷降低。其中蘋果酸的含量在第4 d降至最低值,為(7.58±0.05) mg/g,且差異顯著(P<0.05),富馬酸含量在第6 d含量降至最低,為(0.02±0.03) mg/g,差異顯著(P<0.05)。隨著干制時間的延長,大棗的呼吸作用不斷減弱,有機酸開始快速積累[31]。其中草酸在干制第10 d達到(0.14±0.08) mg/g,蘋果酸、檸檬酸、富馬酸在干制第12 d分別達到(10.15±0.19)、(1.38±0.01)、(0.33±0.08) mg/g。上升幅度從大到小依次為蘋果酸>酒石酸>檸檬酸>富馬酸>草酸,至干制結束第12 d時,草酸與酒石酸含量分別降至(0.08±0.09)、(3.72±0.28) mg/g。

由圖6可知,在整個熱風干制過程中,隨著干制時間的延長,45 ℃熱風干制條件下,總有機酸含量呈現先降低后升高的趨勢,且在干制結束時,干棗中有機酸含量明顯高于鮮棗,這可能與相關代謝酶活性和熱脅迫的影響有關。在干制初期,蘋果酸含量相對較高,在第12 h酸含量降至最低,為(6.62±0.58) mg/g、酒石酸在第12 h含量降至最低,為(3.02±0.09) mg/g?？赡苁且驗殡S著熱風干制時間的不斷延長,導致呼吸作用停止以及酶活性被抑制,有機酸停止消耗,致使各有機酸含量相對升高。草酸在干制第12 h酸含量降至最低,在第52 h含量升至最高。至干制結束第96 h,草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸含量分別為(0.21±0.01)、(5.32±0.29)、(10.41±0.34)、(0.98±0.03)、(0.31±0.13) mg/g。

圖6 45 ℃干制過程中有機酸含量變化規律Fig.6 The variation rule of organic acid content in dry preparation at 45 ℃

綜上所述,哈密大棗在干制過程中主要以蘋果酸、酒石酸、檸檬酸為主,琥珀酸未檢出,表明哈密大棗屬于蘋果酸型果實,這與馬倩倩等[32]的研究基本一致。王恒超等[33]研究了駿棗在干制過程中總酸的變化情況,隨著干制時間的延長,酸含量由于呼吸作用的加強,呈下降趨勢。本實驗研究與其相比,具體測定了總酸中各有機酸的含量變化,趨勢存在差異可能與棗果的品種、有機酸的提取方法以及有機酸含量的計算方式有關。大棗中的蘋果酸與檸檬酸是三羧酸循環途中的主要中間產物,通常情況下可能不會大量的積累,然而有機酸含量的不斷降低主要是在干燥過程中一部分有機酸轉變為糖,一部分則氧化成CO2和H2O。而大棗中檸檬酸的積累,可能是在TCA過程中,上游階段檸檬酸的合成比較活躍,而下游階段的分解環節受抑制等原因造成的[34]。干燥過程中,蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸(SDH)的活性變化,均對蘋果酸的積累和降解有顯著影響[35]。45 ℃熱風干制和自然曬干相比,在干制結束時,蘋果酸、檸檬酸的含量無明顯差異(P>0.05)。其中自然曬干在12 d時結束干制,45 ℃熱風干制在96 h時結束干制,由此相對較低的感知溫度處理,可以縮短干制時間,又能保存大量的生理活性物質。

3 結論

本次實驗建立了哈密大棗有機酸含量測定的高效液相色譜分析方法,并利用此方法測定了哈密大棗在自然曬干與45 ℃熱風干制過程中5種有機酸含量的變化。研究表明,不同干制方式處理哈密大棗在干燥過程中,5種有機酸含量變化趨勢呈現明顯差異,琥珀酸未檢出,有機酸變化由高到低的順序依次為:蘋果酸>酒石酸>檸檬酸>富馬酸>草酸。各有機酸的含量以干基計算,消除了干燥過程中水分散失對有機酸的影響,更真實地反映了有機酸種類和含量的內在變化形式,從而建立了一種較高效、便捷的測定大棗中有機酸含量的方法,相較傳統的有機酸檢測方法靈敏度高,更加方便快捷。實驗過程中未測定在干制過程中影響哈密大棗有機酸的相關酶活性變化,酶活性的高低也會影響到果實中有機酸的含量。因此,對哈密大棗在干制過程中有機酸代謝的相關酶活性的測定還有待進一步的研究。