雙刺參膠囊中紫丁香苷及人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量測定

邸 松,鐘方麗,王曉林,王 璐,高 園

(吉林化工學院化學與制藥工程學院,吉林吉林 132022)

雙刺參膠囊是由刺玫果、刺五加及人參三味中藥材經過適當工藝加工而成的保健食品,其擬申報的保健功能為緩解體力疲勞。蘇聯學者N·布赫曼以“第三狀態”描述了其所發現的非健康非疾病的狀態,即亞健康狀態[1]。疲勞是亞健康人群一種常見的狀態[2],長期處于該狀態下的人群,其免疫系統存在明顯異常甚至受損[3]。

保健食品是一種適用于特定人群使用,具有調節機體功能,不以治療疾病為目的食品[4]。中藥類保健食品,是在中醫“藥食同源”基礎上[5],以中藥為主要成分的具有保健養生功能的特殊食品[6]。刺玫果含有豐富的黃酮及皂苷類成分,具有抗疲勞、抗衰老、增強免疫力、保肝、促智等藥理作用[7]。刺五加主要含有三萜、木脂素、皂苷類成分等,具有增強機體免疫力、緩解體力疲勞、保護神經中樞系統等藥理活性[8]。人參皂苷是人參的主要活性成分,具有抗衰老、抗抑郁等多種保健功效[9]。在國家公布的《關于進一步規范保健食品原料管理的通知》中,人參、刺玫果及刺五加均屬于可用于保健食品的藥食同源類藥材[10]。大量文獻表明,三者提取物中的皂苷類成分均具有較強的抗疲勞功效[11-13],其中人參三醇型皂苷(人參皂苷Rg1、人參皂苷Re)、二醇型皂苷(人參皂苷Rb1)[14]及紫丁香苷[15]為主要活性成分。梁少雄[16]和姜麗萍等[17]采用高效液相色譜法分別測定了參苓白術散和復方雙參顆粒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量;姚路路等[18]和奉艷花等[19]采用乙腈-水梯度洗脫,分別測定刺五加甘草顆粒和壯藥愈瘍散中紫丁香苷的含量。在工業生產中,質量檢測儀器需長時間工作,在檢測過程中流動相流速、柱溫箱溫度、檢測器靈敏度會出現不同程度的波動,且隨著儀器使用時間加長,波動將逐漸明顯,所以對于方法的耐用性要求較高。研究者大多只建立了檢測方法,未對方法的耐用性進行評價。

本研究采用高效液相色譜法,在建立雙刺參膠囊中4種有效成分的含量測定方法的同時,對檢測方法的耐用性進行評價,為雙刺參膠囊的進一步研究及質量標準的制定提供了基礎數據,也為后續工業生產過程中質量檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙刺參膠囊 自制;人參、刺五加、刺玫果 中藥飲片,吉林國安藥業有限公司;人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1純度>98.5%,成都曼思特生物科技有限公司;紫丁香苷 純度>99.5%,成都曼思特生物科技有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,天津市大茂化學試劑廠;其余試劑 均為國產分析純。

Agilent-1260型高效液相色譜儀 配有DAD陣列檢測器,安捷倫科技有限公司;1201型高效液相色譜儀 配有UV檢測器,大連依利特分析儀器有限公司;FA2004N型電子分析天平 上海精密科學儀有限公司;SK5210HP型超聲波清洗器(超聲功率:200 W,工作頻率:53 kHz) 上?？茖С晝x器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙刺參膠囊的制備 取人參粉、刺玫果粉、刺五加粉按處方量混合,加入5倍量90%乙醇,于80 ℃水浴提取2次,每次1 h。合并濾液,60 ℃減壓濃縮為稠膏,干燥,粉碎成細分,加入適量淀粉混合均勻,制粒、干燥,加入顆粒質量1%的硬脂酸鎂,混勻,灌裝至1#膠囊中,既得雙刺參膠囊(每粒0.35 g)。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 供試品溶液的制備 取10粒雙刺參膠囊內容物,將內容物混合研碎,精密稱取1.0 g,置于燒瓶中,加20 mL甲醇,超聲處理(功率200 W,頻率53 kHz)30 min,放冷后過濾,濾渣經甲醇洗滌,將濾液及洗滌液轉移至25 mL容量瓶中,定容至刻度,即得。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 分別稱取干燥至恒重的人參皂苷Rg1、Re、Rb1各約10 mg,精密稱定,分別置于10 mL容量瓶中,加入甲醇溶解并定容。分別吸取上述溶液各3.0 mL,置于10 mL容量瓶中,混合,定容,即得質量濃度分別為0.369、0.306、0.339 mg/mL的人參皂苷Rg1、Re、Rb1的混合對照品溶液。

稱取干燥至恒重的紫丁香苷對照品約2 mg,精密稱定,置于50 mL棕色容量瓶中,加入適量甲醇溶解,定容,即得質量的濃度為0.046 mg/mL的紫丁香苷對照品溶液。

1.2.3 檢測方法的建立

1.2.3.1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1色譜條件的選擇 人參皂苷因為具有較多的藥、食功效[20],進而有比較成熟的含量檢測方法,本實驗通過文獻查閱[21-23],使用Nano-Micro UniSil 5-120 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長203 nm,柱溫35 ℃,進樣量10 μL,分別考察乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸水梯度洗脫,根據目標峰的分離度、保留時間、拖尾因子等因素優選出適用于雙刺參膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量測定的色譜條件。

1.2.3.2 紫丁香苷色譜條件的選擇 柱溫30 ℃,進樣量10 μL,流速1.0 mL/min,檢測波長265 nm,分別使用依利特ODS2、BDS-C18及APS色譜柱,考察乙腈-水(10∶90)、乙腈-水(15∶85)等度洗脫及乙腈-水梯度洗脫,根據目標峰的理論板數、保留時間、峰形等因素確定其色譜條件。

1.2.4 含量測定的方法學考察

1.2.4.1 標準曲線的繪制 分別吸取人參皂苷混合對照品溶液、紫丁香苷對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL于10 mL容量瓶中,定容,分別在對應色譜條件下進樣,記錄峰面積,以各成分的質量濃度作為橫坐標,對應的峰面積作為縱坐標進行線性回歸,得到標準曲線方程。

1.2.4.2 檢測限及定量限的確定 吸取紫丁香苷及人參皂苷混合對照品溶液,加入甲醇按比例進行稀釋。在色譜條件下進樣,分別記錄各成分峰面積,當信噪比為3和10時,計算各成分對應的質量濃度,即為各成分所對應的檢測限和定量限。

1.2.4.3 精密度實驗 精密吸取人參皂苷混合對照品溶液及紫丁香苷對照品溶液、供試品溶液各10 μL,在相應色譜條件下連續進樣6次,記錄各成分的峰面積,并計算RSD值。

1.2.4.4 重復性實驗 取同一批次雙刺參膠囊,按照供試品溶液制備方法進行溶液制備。按照色譜條件進樣6次,分別記錄人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷的峰面積,并計算RSD值。

1.2.4.5 穩定性實驗 吸取同一供試品溶液,分別在0、6、12、24、36、48 h進樣,記錄目標峰的峰面積,計算RSD值。

1.2.4.6 系統耐用性實驗 在選定的流動相條件下,通過測定條件(檢測波長、流動相流速及檢測溫度)及色譜柱的改變,對樣品再次進行含量測定,以測定的含量為依據,進行耐用性考察。

1.2.5 加樣回收率實驗

1.2.5.1 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1的回收率實驗 稱取已知含量的雙刺參膠囊內容物6份,每份1.0 g,精密稱定,分別加入1.47 mg的人參皂苷Rg1、1.90 mg的人參皂苷Re及3.67 mg的人參皂苷Rb1,按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液,在人參皂苷檢測的色譜條件下進樣,記錄各目標峰的峰面積,計算回收率。

1.2.5.2 紫丁香苷的回收率實驗 稱取適量已知紫丁香苷含量的雙刺參膠囊內容物9份,每份1.0 g,精密稱定,每3份為一組,分別加入已知含量50%、100%及150%的紫丁香苷,按照供試品溶液制備方法進行溶液制備,在色譜條件下進樣,記錄紫丁香苷的峰面積,計算紫丁香苷回收率。

1.2.6 雙刺參膠囊中有效成分的含量測定 稱取雙刺參膠囊內容物3份,每份1.0 g,精密稱定,按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液。分別在對應各成分的色譜條件下進樣,測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷的含量。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次,取平均值,數據處理采用安捷倫1260型高效液相脫機工作站,及Origin作圖整理。

2 結果與分析

2.1 供試品溶液制備方法的選擇

實驗考察了超聲次數對各成分轉移率的影響,取1.0 g樣品,加入甲醇超聲(功率200 W,頻率53 kHz)處理30 min,放冷至室溫,過濾,使用甲醇洗滌濾渣,合并濾液及洗液后定容為25 mL。剩余濾渣重復上述操作3次,得到4組供試品溶液,分別在色譜條件下進樣,測定結果顯示經過1次超聲處理,供試品中的4中皂苷類成分轉移至溶劑中的轉移率均大于96.5%,可視為完全轉移。故最終選擇超聲處理1次制備供試品溶液。

2.2 檢測方法的確定

當人參皂苷的檢測選用流動相乙腈-0.4%磷酸水梯度洗脫時,人參皂苷Rg1及人參皂苷Re無法分離。在檢測紫丁香苷時,選用依利特ODS2色譜柱時采用乙腈-水等度洗脫無目標峰出現,采用乙腈-水梯度洗脫時目標峰拖尾嚴重;選用BDS-C18色譜柱時,各組流動相下目標成分的分離度小于1.5;選用APS色譜柱,采用乙腈-水等度洗脫時,紫丁香苷對應峰分離度較低。最終確定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量測定的色譜條件為:Nano-Micro UniSil 5-120 C18色譜柱,以乙腈-水為流動相,按一定梯度洗脫,梯度洗脫程序見表2,柱溫35 ℃,檢測波長203 nm,進樣量10 μL,流速1.0 mL/min;紫丁香苷含量測定的色譜條件為:APS色譜柱,以乙腈-水作為流動相梯度洗脫(表3),柱溫30 ℃,檢測波長265 nm進樣量10 μL,流速1.0 mL/min。在對應色譜條件下,各成分的保留時間、分離度、理論塔板數及拖尾因子見表4。對應的HPLC色譜圖見圖1。高效液相色譜法測定相關成分含量時,系統適應性要求分離度應大于1.5,主峰拖尾因子不得大于2.0,理論塔板數應大于3000,從表4中可以看出,4種有效成分目標峰的理論塔板數均大于20000,分離度均大于2.12,說明色譜柱柱效較好,4種物質目標峰與相鄰峰完全分離。由4種物質的拖尾因子可知,人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對稱性較好,人參皂苷Rb1和紫丁香苷略有拖尾現象。

表2 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、 人參皂苷Rb1的梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure of ginsenoside Rg1,Re,Rb1

圖1 雙刺參膠囊的HPLC譜圖Fig.1 HPLC spectra of Shuangcishen capsules注:A:人參皂苷混合對照品色譜圖(波長:203 nm);B:紫丁香苷色譜圖(波長:265 nm);C:供試品溶液色譜圖(C1波長:203 nm;C2波長265 nm);1:人參皂苷Rg1;2:人參皂苷Re;3:人參皂苷Rb1;4:紫丁香苷。

表3 紫丁香苷的梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution procedure for syringin

表4 4種成分的色譜數據Table 4 Chromatogram data of four kinds of components

2.3 含量測定的方法學考察實驗結果

2.3.1標準曲線繪制的實驗結果 4種有效成分均以質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線,擬合方程、線性范圍、檢測限及定量限見表5。由實驗結果可知,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷的進樣質量濃度分別為15.30～306.00、16.95～339.00、18.45～369.00、4.60～46.00 μg/mL范圍內與其峰面積值呈良好的線性關系,其檢測限分別為:0.77、0.89、0.93、0.12 μg/mL,其定量限分別為:2.21、2.71、2.74、0.38 μg/mL。

表5 標準曲線繪制實驗結果Table 5 Standard curve drawing test result

2.3.2 精密度、重復性及穩定性實驗結果 實驗結果顯示,在上述色譜條件測定雙刺參膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷,儀器精密度良好,方法重復性較好,供試品溶液在48 h內穩定,滿足測定要求。詳細實驗結果見表6。

表6 方法學考察實驗結果(n=6)Table 6 Methodological investigation result(n=6)

2.3.3 系統耐用性實驗結果 在測定條件微小調整后對樣品進行含量測定,相應色譜條件下的樣品含量測定值對應的RSD值均小于3%,表明測定方法耐用性良好,實驗結果見表7、表8。

表7 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1系統耐用性實驗結果Table 7 System durability test results of ginsenoside Rg1,Re,Rb1

表8 紫丁香苷系統耐用性實驗結果Table 8 System durability test result for syringing

2.3.4 加樣回收率實驗結果 根據表9、表10可知,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷的平均加樣回收率分別為100.13%、100.50%、102.33%、101.55%,RSD值分別為0.67%、0.99%、0.29%、0.68%,說明該方法準確度高,可用于雙刺參膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、紫丁香苷的含量測定。

表1 供試品溶液制備方法實驗結果Table 1 Preparation method test results of test solution

表9 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1加樣回收率實驗結果(n=6)Table 9 Test results of ginsenoside Rg1,Re,Rb1 loading recovery(n=6)

表10 紫丁香苷加樣回收率實驗結果(n=9)Table 10 Syringin recovery test results(n=9)

2.3.5 樣品中各有效成分含量測定的實驗結果 3批雙刺參膠囊含量測定結果顯示,人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量分別為137.90、189.58、356.83 mg/100 g(相當于每粒含0.48、0.66、1.25 mg),紫丁香苷為114.99 mg/100 g(相當于每粒含0.40 mg),實驗結果表明雙刺參膠囊中含有抗疲勞活性成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷,且不同批次樣品中4種有效成分含量相差不大。實驗數據見表11。

表11 樣品含量測定的實驗結果Table 11 Test results of sample content determination

3 結論

本研究選用人參、刺五加、刺玫果三種藥食同源藥材,制備了抗疲勞保健食品雙刺參膠囊。采用HPLC建立了雙刺參膠囊中4種有效成分含量測定的方法。在檢測條件下,測得每粒雙刺參膠囊中含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及紫丁香苷分別為0.48、0.66、1.25、0.40 mg,且各有效成分分離度均大于2.0,理論塔板數均大于20000,符合相關含量測定標準。該方法簡便準確,重復性好,方法穩定可行,可用于雙刺參膠囊質量控制。

雙刺參膠囊屬中藥類抗疲勞保健食品,在后續的研究中,將會借鑒中藥制劑的“一測多評”法,使用超高效液相色譜儀,在縮短檢測時間的基礎上,探索可同時測定雙刺參膠囊中更多有效成分含量的方法,為雙刺參膠囊的進一步研究提供基礎。