漢源花椒總黃酮提取物的抗氧化及抗Hela腫瘤細胞增殖活性研究

徐一鳴,郭秀蘭,李秋霞,李俊鋒,唐仁勇,鄒 強,杜小剛

(1.成都大學藥學與生物工程學院,四川成都 610106; 2.四川農業大學生命科學學院,四川雅安 625014)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)系蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物,其果實是我國特別是西南地區的特色調味品,以味麻著稱,具有降血脂[1]、抗氧化[2]、抑菌抗蟲[3]等保健功能?；ń吩谌珖鞯囟加性苑N,而其中又以漢源花椒較為出名,漢源花椒是我國雅安市漢源縣特產,與其他花椒相比具有色澤鮮艷和麻味濃厚等特點。從唐代開始,漢源花椒就是朝廷貢品,因此又被稱為貢椒[4]。漢源花椒產量高,主要產品為花椒粉、花椒油等調味料?；ń穬群袚]發油[5]、總黃酮、總多酚[6]等多種活性成分,其中的黃酮是一類具有2-苯基色原酮(2-phenyl-chromones)結構的多酚類化合物,具有抗氧化、抗腫瘤[7]等生物活性。

自由基是一類具有不成對電子的原子或基團,具有很高的氧化活性,很容易與其他物質發生化學反應。適量自由基可以促進膠原蛋白和凝血酶原的合成并提高人體免疫力;而過量的自由基會破壞細胞膜的結構功能和引起基因損傷并導致變異[8],甚至引發心血管疾病、癌癥、炎癥和糖尿病等疾病[9-10]。因此,有效抑制自由基的氧化反應顯得至關重要。合成抗氧化劑具有潛在毒副作用[11],目前研究熱點主要集中在具有抗氧化活性的天然產物。已有研究表明花椒葉的黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性[12],但是關于漢源花椒抗氧化性方面的研究還鮮有報道。

癌細胞是由正常細胞的原癌基因與抑癌基因發生突變產生的,具有可以無限增殖、易轉化和易轉移的特點,這也是惡性腫瘤形成的原因?；熀头暖熓侵委煇盒阅[瘤的主要手段,但對正常細胞有強烈的副作用;而近年來天然產物因具有良好的抗癌活性和低毒性受到人們的關注。研究發現黃酮可以抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、阻滯細胞分裂周期和抑制腫瘤新生血管形成,具有良好的抗腫瘤活性[13],是一類良好的可用作癌癥治療的天然產物資源。但是目前還沒有關于花椒黃酮抗腫瘤細胞增殖方面的研究。

因此,本實驗以漢源花椒總黃酮提取物為實驗材料,通過DPPH自由基、·OH清除等實驗評價總黃酮提取物的體外抗氧化能力,并以不同濃度提取物處理Hela細胞,研究對Hela細胞的抗增殖作用,以期為漢源花椒功能性產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢源花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim) 產地為四川漢源;Hela細胞 中科院上海生科院細胞資源中心;蘆丁標準品(HPLC≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;CCK-8試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司;碘化丙啶(PI) 凱基生物科技發展有限公司;EGFP-Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒 廣州易錦生物技術有限公司;二甲基亞砜(DMSO) 北京索萊寶科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 北京索萊寶科技有限公司;其余試劑 均為國產分析純。

KQ3200DA型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司;RE52CS-1旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;BIOMATE 3S 分光光度計 美國Thermo公司;Forma Steri-Cycle CO2培養箱 美國Thermo公司;Synergy HT酶標儀 美國BIO-TEK公司;Sorvall ST 16R離心機 美國Thermo公司;Accuri C6流式細胞儀 美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 漢源花椒總黃酮的提取 參考楊立琛等[14]和李谷才等[15]方法,并做出一定改進。稱取2 g的花椒粉末,加到35 mL石油醚中,常溫,150 W密封超聲30 min,抽濾后留粉末烘干并轉移到三角瓶中,然后加入20%乙醇80 mL,65 ℃,150 W密封超聲2 h,抽濾取大孔樹脂。加入60%乙醇80 mL，常溫振蕩4 h(120 r/min)抽濾留濾液,再加入10 g預處理后的D101-大孔吸附樹脂(蒸餾水浸泡24 h,反復沖洗至無渾濁;4%NaOH浸泡12 h,蒸餾水洗至中性;4%HCl浸泡12 h，蒸餾水洗至中性;95%乙醇浸泡3 h,蒸餾水洗至無醇味)常溫振蕩4 h(120 r/min),抽濾后取大孔樹脂，加入60%乙醇80 mL，常溫振蕩4 h(120 r/min)抽濾留濾液。再將濾液進行50 ℃旋蒸,當濾液渾濁且無酒精蒸出后停止旋蒸,最后濾液在-80 ℃冰箱過夜后使用凍干機凍干。

1.2.2 黃酮得率測定 參考宋倩等[16]方法,稱取10 mg蘆丁標準品溶于50 mL容量瓶中,用60%乙醇定容得到質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準液。分別取蘆丁標準液加到10 mL容量瓶中(0、1、2、3、4、5 mL),加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液,反應6 min,然后加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液,反應6 min,最后加入4 mL 4% NaOH溶液4 mL,用30%乙醇定容后搖勻,顯色15 min。在510 nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,蘆丁標準品質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線,建立方程為y=6.39x-0.0112,R2=0.9995,y為吸光度,x為黃酮質量濃度mg/mL。

提取黃酮得率的測定:稱取10 mg凍干得到的總黃酮提取物溶于10 mL 30%乙醇配制樣品液,取1 mL樣品液按上述方法測定吸光度,黃酮濃度使用上述方程計算。黃酮得率計算按下列公式:

式中,C提為依據標準曲線算出來的黃酮提取液中黃酮質量濃度,mg/mL;V樣為乙醇體積,mL;m提為凍干后總黃酮提取物總質量,mg;m花為花椒粉末質量,g;m樣為稱取的凍干后總黃酮提取物質量,mg。

1.2.3 漢源花椒總黃酮提取物抗氧化活性的測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力檢測 參考Amarowicz等[17]方法,使用甲醇配制總黃酮提取物溶液和VC溶液(0、25、50、75、100、125 μg/mL),取1 mL待測液加到1 mL,0.5 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液中,再用甲醇定容到5 mL。搖勻靜置30 min?？瞻讓φ战M用蒸餾水代替DPPH。在517 nm波長處測定吸光度。實驗重復三次,根據下列公式計算清除率:

式中,A0為質量濃度為0的吸光度;A測為不同質量濃度下的吸光度;A空為不同質量濃度下空白對照組吸光度。

1.2.3.2 羥自由基(·OH)清除能力檢測 參考范菁華等[12]方法,使用無水乙醇配制總黃酮提取物溶液和VC溶液(0、62.5、125、250、400、500 μg/mL),反應體系為1 mL待測液、1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液、1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和1 mL H2O2溶液,混勻后37 ℃水浴1 h,空白對照組用蒸餾水代替水楊酸。在520 nm波長處測定吸光度。實驗重復三次,根據下列公式計算清除率:

式中,A0質量濃度為0的吸光度;A測為不同質量濃度下的吸光度;A空為不同質量濃度下空白對照組吸光度。

1.2.3.3 還原力檢測 參考高亞妮等[18]方法,使用70%乙醇配制總黃酮提取物溶液和VC溶液(0、25、50、100、200、400 μg/mL),取2.5 mL待測液,加到2.5 mL 10 mg/mL鐵氰化鉀中,50 ℃水浴20 min,然后加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸,混勻后離心20 min(3000 r/min),再取2.5 mL上清液,加入蒸餾水2.5 mL和1 mg/mL FeCl30.5 mL,搖勻靜置10 min。在700 nm波長處測定吸光度。實驗重復三次,吸光度越大,代表還原力越強。

1.2.3.4 總抗氧化能力檢測 參考Ozkan G等[19]方法,使用無水乙醇配制總黃酮提取物溶液和VC溶液(0、50、100、200、250、300 μg/mL)和磷鉬試劑液(含0.6 mol/L濃硫酸、28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨),取0.4 mL待測液,加到4 mL磷鉬試劑液中,搖勻后95 ℃水浴加熱90 min,在695 nm波長處測定吸光度。實驗重復三次,吸光度越大,代表總抗氧化能力越強。

1.2.4 漢源花椒總黃酮提取物抗增殖活性的測定

1.2.4.1 細胞培養 Hela細胞以適當濃度接種于培養瓶中,使用含10%胎牛血清,1‰青霉素鏈霉素混合液的1640培養基,在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱培養,每兩天傳代一次。

1.2.4.2 細胞增殖活性檢測 實驗組取對數生長期的Hela細胞,按8000個細胞,75 μL/孔接種于96孔板上,空白對照組按75 μL/孔加入含血清1640培養基;使用含2‰ DMSO的無血清培養基配制藥物(花椒總黃酮濃度0、50、100、200、400、800 μg/mL),接種細胞4 h后按75 μL/孔加入96孔板。在5% CO2、37 ℃培養箱中孵育12、24、48 h后,按10 μL/孔加入CCK-8溶液后再孵育1 h,然后在450 nm酶標儀下測定吸光度。實驗組設置5個復孔。根據下列公式計算細胞生存率:

式中,A0為提取物質量濃度為0的吸光度;A測為不同質量濃度下的吸光度;A空為不同質量濃度下空白對照組吸光度。

1.2.4.3 細胞周期檢測 參考李云坤等[20]方法,取對數生長期的Hela細胞,按3×105個細胞,1 mL/孔接種于12孔板上;使用含2‰ DMSO的無血清培養基配制藥物(花椒總黃酮提取物0、100、200、400、800、1600 μg/mL),接種細胞6 h后按1 mL/孔加入12孔板,在5% CO2、37 ℃培養箱中孵育24 h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液離心(300×g,5 min)收集細胞,然后用4 ℃預冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗兩次(800 r/min,5 min),再用預冷70%乙醇重懸細胞,4 ℃冰箱過夜,次日使用預冷PBS洗一次,最后加入500 mL PBS(含50 μg/mL PI和100 μg/mL RNA酶),4 ℃避光反應20 min。使用流式細胞儀檢測,每次計數20000個細胞,實驗組設置3個復孔。結果使用FLOWJO-V10軟件分析。

1.2.4.4 細胞凋亡檢測 取對數生長期的Hela細胞,按5×105個細胞,1 mL/孔接種于6孔板上;使用含2‰DMSO的無血清培養基配制藥物(花椒總黃酮提取物0、100、200、400、800、1600 μg/mL),接種細胞6 h后按1 mL/孔加入6孔板,在5%CO2、37 ℃飽和濕度下孵育24 h后,使用不含EDTA的胰蛋白酶消化液離心(300×g,5 min)收集細胞于5 mL流式管內,然后用4 ℃預冷的PBS洗兩次,再使用100 μL 1×Annexin-binding buffer重懸細胞,接著加入5 μL EGFP AnnexinV和2 μL PI,輕輕混勻,室溫避光反應15 min,最后加入400 μL 1×Annexin-binding buffer,檢測前放置于冰上。使用流式細胞儀檢測,每次計數20000個細胞,實驗組設置3個復孔,結果使用FLOWJO-V10軟件分析。

1.3 統計方法

應用GraphPad prism5統計軟件進行數據分析,多組間單因素分析使用One-way ANOVA,雙因素分析使用two-way ANOVA,P<0.05表示有顯著差異,P<0.01表示有非常顯著差異,P<0.001表示有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 花椒黃酮的得率

本研究采用超聲波輔助溶劑進行提取,繼而用大孔樹脂純化并冷凍干燥得到花椒黃酮提取物,其黃酮得率為2.19%,略高于用超聲波輔助提取法提取四川花椒果實黃酮得率(2.13%)[15],說明提取方法是可行的。

2.2 花椒黃酮的抗氧化性

黃酮具有強抗氧化性的原因主要是在于其芳香環上的羥基,它們可結合并清除自由基,且清除能力與羥基的數目和位置有關[21-22]。本研究測定了總黃酮提取物對DPPH自由基和·OH的清除率,并評價了對三價鐵的還原能力與誘導形成磷鉬絡合物的能力,從多個方面研究了總黃酮提取物的抗氧化能力。

2.2.1 黃酮提取物清除DPPH自由基能力 由圖1可知,總黃酮提取物對DPPH自由基有清除效果,并且隨著質量濃度增大,清除率迅速提高。在提取物質量濃度為125 μg/mL清除率最大達到84.70%,此質量濃度下VC的清除率為94.51%,總黃酮提取物與VC的IC50值分別為65.61和4.92 μg/mL。因此,在本實驗質量濃度范圍內,總黃酮提取物具有較好的DPPH自由基清除效果且呈劑量依賴性,清除能力弱于VC,但是強于黃秋葵黃酮與氯仿萃取的鐵皮石斛黃酮[23-24],它們的IC50值分別為2980.00和394.62 μg/mL。

圖1 總黃酮提取物對DPPH自由基清除效果Fig.1 Scavenging effects of total flavonoids extracts on DPPH·

2.2.2 總黃酮提取物清除·OH能力 由圖2可知,總黃酮提取物有清除·OH的能力,并且隨著質量濃度增大,清除能力逐漸增強;在質量濃度為500 μg/mL時清除率最大達到83.61%,此質量濃度下VC的清除率為84.07%,VC和總黃酮提取物的IC50值分別為189.80、194.40 μg/mL。因此,在本實驗質量濃度范圍內,總黃酮提取物對·OH有一定清除能力,并呈劑量依賴性,其清除能力和VC相比無較明顯差異,但是強于黃秋葵黃酮與氯仿萃取的鐵皮石斛黃酮,IC50值分別為6000.00和1589.03 μg/mL[24-25]。

圖2 總黃酮提取物對·OH清除效果Fig.2 Scavenging effects of total flavonoids extracts on ·OH

2.2.3 總黃酮提取物還原力 由圖3可知,總黃酮提取物具有還原力,并且隨著質量濃度增大,吸光度呈上升趨勢且接近線性,即還原能力不斷增強。在提取物質量濃度為400 μg/mL時,吸光度為0.70,而此質量濃度下VC的吸光度為1.48。因此,在本實驗質量濃度范圍內,總黃酮提取物具有一定的還原力且呈劑量依賴性,雖然其還原力不如VC,但大于堿蓬黃酮(25～50) mg/mL[25]。

圖3 總黃酮提取物還原力Fig.3 Reducing power of total flavonoids extracts

2.2.4 總黃酮提取物總抗氧化活性 由圖4可知,總黃酮提取物具有總抗氧化能力,并且隨著質量濃度增大,吸光度緩慢增長,即抗氧化活性緩慢提高。當提取物質量濃度為300 μg/mL時,吸光度達到最大值0.48;而此質量濃度下VC吸光度為1.54。因此,在本實驗質量濃度范圍內,總黃酮提取物有一定的抗氧化能力,且呈劑量依賴性,在質量濃度為300 μg/mL時總抗氧化能力高于該質量濃度下的茼蒿葉總黃酮[26],但遠弱于VC。

圖4 總黃酮提取物總抗氧化能力Fig.4 Total anti-oxidative power of total flavonoids extracts

總的來說,漢源花椒總黃酮提取物具有抗氧化活性,雖然抗氧化活性不如VC,但是DPPH自由基與·OH清除率的IC50值小于黃秋葵黃酮和鐵皮石斛黃酮,相同質量濃度下的還原力強于堿蓬黃酮,總抗氧化能力強于茼蒿葉黃酮,說明漢源花椒具有良好的抗氧化活性,是一種有開發價值的植物資源。

2.3 總黃酮提取物對Hela細胞增殖的影響

由圖5可知,總黃酮提取物引起細胞生存能力下降,并且隨著提取物質量濃度提高,細胞生存能力在逐漸下降;與相同處理時間的對照組相比,用200～800 μg/mL總黃酮提取物處理12 h后極顯著降低了Hela細胞的生存能力(P<0.001);用50 μg/mL處理24 h后顯著降低了Hela細胞的生存能力(P<0.01);100～800 μg/mL處理24 h極顯著地降低了Hela細胞的生存能力(P<0.001);用50～800 μg/mL處理48 h后極顯著地降低了Hela細胞的生存能力(P<0.001)。且生存能力隨黃酮濃度的增加而降低,在800 μg/mL時不同處理時間的細胞生存率達都到最低,12、24和48 h分別為27.15%、10.43%和30.63%;IC50值分別為454.3、271.1和361.9 μg/mL。因此,在本實驗質量濃度范圍內,總黃酮提取物能顯著抑制Hela細胞增殖,且呈劑量依賴性;但可能是因為細胞的適應能力,提取物長時間處理后對細胞增殖的抑制效果減弱,因此在后續實驗中,選擇提取物抑制效果最好的處理時間24 h進行后續實驗。

圖5 不同質量濃度下Hela細胞的生存能力Fig.5 Viabilities of Hela cells at various mass concentrations注:**表示相同處理時間的實驗組與對照組相比差異 非常顯著(P<0.01);***表示相同處理時間的實驗組 與對照組相比差異極顯著(P<0.001);圖6～圖8同。

2.4 總黃酮提取物對Hela細胞周期的影響

細胞周期阻滯是指正常細胞受到外來因子的刺激后,周期調控蛋白的異常表達導致細胞無法進行正常有絲分裂,從而引起細胞增殖抑制。由圖6可知,總黃酮提取物使細胞周期阻滯在G2/M期。對照組細胞培養24 h后處于各周期細胞數量所占比例分別為:G0/G1期57.76%,S期27.23%和G2/M期22.49%;在最高質量濃度下G0/G1期細胞數量所占比例極顯著下降到40.85%(P<0.001),S期為28.7%,無明顯變化,而G2/M期極顯著上升到40.01%(P<0.001)。這與前人結果類似,研究表明植物黃酮類物質有阻滯癌細胞分裂的作用:木犀草素-7-O-葡萄糖苷通過上調JNK信號通路引起人肝癌HepG2細胞的G2/M期阻滯[27]、黃芪總黃酮和毛蕊異黃酮通過下調G1/S-特異性周期蛋白D1的表達使K562人慢性髓系白血病細胞的G0/G1期細胞增多[28]。因此,在本實驗質量濃度范圍內,高質量濃度的總黃酮提取物會擾亂Hela細胞正常周期,使其阻滯在G2/M期,干擾了細胞正常有絲分裂的進行

圖6 不同質量濃度下細胞周期分布比例Fig.6 Proportion of the cell cycle distribution at various mass concentrations

。

2.5 總黃酮提取物對Hela細胞凋亡的影響

細胞凋亡又稱細胞自殺,是細胞為了維護內環境的穩態主動進行的程序性死亡,受一系列基因的調控,這也是抑制細胞增殖的原因之一。由圖7、圖8可知,總黃酮提取物會誘導細胞凋亡,并且隨著藥物質量濃度上升,細胞凋亡率逐漸升高。對照組細胞藥物處理24 h后的早期凋亡率(LR)為4.25%,晚期凋亡率(UR)為12.18%,早期和晚期凋亡率都隨黃酮提取物濃度的增加而逐漸提高,當800 μg/mL濃度處理24 h后早期凋亡率達到15%,晚期凋亡率達到74.3%,極顯著高于對照組(P<0.001),且鏡下觀察發現有明顯的凋亡小體。這與前人結果相似:槲皮素可以通過上調AMPK/p38信號通路誘導HT-29 結腸癌細胞凋亡[29]。因此總黃酮提取物會誘導細胞凋亡,且呈劑量依賴性,這很可能是提取物引起細胞增殖抑制的原因。

圖7 總黃酮提取物對Hela細胞凋亡影響Fig.7 Effect of total flavonoids extracts on the apoptosis of Hela cells

圖8 不同質量濃度下細胞凋亡率Fig.8 Cell apoptosis rates at various mass concentrations

3 結論

本研究采用超聲波輔助提取結合大孔樹脂純化的方法制備了漢源花椒黃酮,并研究其抗氧化活性及對人宮頸癌Hela細胞的增殖和細胞周期的影響。結果表明,漢源花椒總黃酮提取物具有較強的DPPH和羥自由基的清除能力,同時具備一定的還原力與總抗氧化能力;腫瘤細胞實驗中發現漢源花椒黃酮在800 μg/mL處理24 h可最大限度地降低Hela細胞生存率,這可能與該濃度提取物處理24 h的細胞發生G2/M期阻滯和細胞凋亡率升高有關。這些結果說明漢源花椒黃酮具有良好的抗氧化活性,且具有抑制腫瘤細胞增殖的活性,是一種具有開發價值的植物資源。