食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞吸收相關蛋白表達的影響

劉 瑩,解軍波,張彥青,*

(1.天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津 300134; 2.天津中醫藥大學中藥學院,天津 301617)

多糖是10個以上的單糖分子由糖苷鍵聚合而形成的大分子化合物,其廣泛存在于動物、植物細菌和真菌中[1]。多糖與人們的飲食息息相關。大量研究表明多糖具有多種生物活性,例如抗腫瘤[2]、調節免疫[3]、降血糖[4]、降血脂[5]等,多糖具有來源廣泛、無毒副作用等優點,已經成為新藥研發和保健食品研發的熱點。

多糖到底通過什么樣的途徑發揮其生物作用還沒有明確定論。近年來,腸道菌群越來越引起人們的關注,腸道菌群是位于腸道的微生物群,與人體的消化吸收等一系列生命活動密切相關[6]。人體自身含有的酶很難消化植物多糖,需要依靠腸道菌將其降解,并且腸道菌對植物多糖的選擇性消化也同樣影響著腸道微生物中不同菌種的豐富度,改變了腸道菌群的多樣性[7-8]。有研究認為腸道菌群是多糖發揮其藥理作用的重要媒介。目前有研究表明,多糖可以改變其他物質的吸收[9]、調節體內的外排轉運蛋白[10]、增強腸的機械屏障[11]等。酸棗仁是鼠李科植物酸棗的種子[12],其具有抗焦慮、抗抑郁、神經保護、強心、治療失眠等多種藥理作用[13-15]。研究發現酸棗仁湯能夠調節C57BL/6小鼠的腸道菌群,緩解慢性睡眠剝奪導致的肝損傷[16]。酸棗仁多糖(ZSSP)是從酸棗仁中提取出來的一種多糖,前期研究表明酸棗仁多糖具有明顯的抗炎和調節免疫的生物活性,能促進RAW264.7細胞中NO的釋放,調節細胞內IκB-α和ERK蛋白的磷酸化水平[17]。

本研究旨在探究食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液能否調節Caco-2細胞中外排轉運蛋白、緊密連接蛋白和Ⅱ相代謝酶的表達水平。通過噻唑藍法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測腸道菌群培養上清液對細胞活力的影響,采用免疫印跡法(Western blot)檢測Caco-2細胞中外排轉運蛋白和緊密連接蛋白的表達水平,并用酶聯免疫檢測(ELISA)試劑盒測定Caco-2細胞中Ⅱ相代謝酶的含量,為探究酸棗仁多糖發揮藥理作用的機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁多糖(ZSSP) 本實驗室制備,并采用紫外、紅外和質譜等手段對其進行表征[18],其純度大于98%;6～7周齡的雄性健康C57BL/6小鼠(清潔級)20只,體重約為(20±2) g 天津藥物研究院有限公司(許可證號:SYXK津2016-00013)提供,動物由標準飼料喂養,全程自由飲水,環境溫度為22～24 ℃,適應性喂養一周后開始試驗;標準飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司(產品代碼:LAD3001M);全蛋白提取試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶、DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青鏈霉素 美國Giboc公司;支原體去除劑 Biomedicals公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) 美國Sigma公司;P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關蛋白2(Multidrug resistance-associated protein2,MRP2)、咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白1(Claudin-1)和β-肌動蛋白(β-action)的抗體 美國Abcam公司;磺酸基轉移酶(Sulfotransferase,SULT)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)的酶聯免疫檢測(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 上海泛柯實業有限公司;實驗中所用水 均為超純水;化學試劑 均為分析純。

ZH-2型渦流混合器 北京博鎂基業科學儀器技術有限公司;BP211D型電子分析天平 德國Sartorius公司;HERAcell240i型二氧化碳培養箱、ECO0.9型超凈工作臺、902-ULTS型超低溫冰箱 美國Thermo公司;SpectraMax? M3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司;MLS-3750型高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司;Milli-Q Reference超純水系統 美國MILLIPORE公司;L8-70M型超速離心機 美國Beckman Corporation公司;Tanon-5200全自動化學發光成像分析系統 上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗方法 將C57BL/6小鼠隨機分為對照組和ZSSP組(n=10),對照組灌胃超純水,ZSSP組灌胃酸棗仁多糖100 mg/(kg·d-1),每日給藥一次,連續給藥14 d,在給藥的最后一天,分別取不同組小鼠的糞便,儲存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 腸道菌群培養上清液的制備 用PBS將糞便樣品配制成濃度為20%(w/V)的懸液。在厭氧工作站中用紗布過濾,將濾液與BCM培養基以1∶7的比例完成接種,在厭氧工作站中37 ℃培養2 h。收集腸道菌群培養液以3000 g離心10 min,然后將上清液通過0.22 μm的微孔過濾器過濾除菌。所得樣品可用于細胞實驗[19]。

1.2.3 Caco-2細胞的培養 將Caco-2細胞接種于含10%FBS(100 U/mL青霉素)的DMEM培養基中并置于恒溫培養箱(37 ℃,5%CO2,相對濕度90%)中培養。每兩天更換一次培養液,當Caco-2細胞長滿培養瓶底部70%～80%時(大約4～5 d),處于對數生長期,用含質量體積濃度0.25%的胰蛋白酶消化后,進行傳代。

1.2.4 Caco-2細胞活力值的測定 用MTT法[20]評估腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞活力的影響。將對數期細胞,接種于96孔板(其他孔用PBS填充)。在37 ℃恒溫培養箱中培養12 h后,加入腸道菌群培養上清液(0、1、5、10、20、50、100 μL/mL)孵育24 h;每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL),繼續培養3.5 h后棄去孔內培養液,隨后加入150 μL DMSO,37 ℃孵育10 min。用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度(OD)值,計算細胞活力值。

細胞活力值(%)=(實驗組OD值-調零組OD值)/(對照組OD值-調零組OD值)×100

1.2.5 Caco-2細胞中外排轉運蛋白和緊密連接蛋白表達水平的測定 取對數生長期的Caco-2細胞,接種于6孔板,置于37 ℃恒溫培養箱,待細胞長滿培養孔底部80%～90%,用濃度為50 μL/mL的腸道菌群培養上清液孵育24 h。用全蛋白提取試劑盒提取蛋白,BCA試劑盒測定蛋白含量,使用15%或8%的凝膠通過SDS-PAGE分離出具有等量總蛋白的樣品,并將其轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用5%的脫脂奶封閉PVDF膜2 h,并在4 ℃下一抗孵育過夜。一抗分別為P-gp、MRP2、Occludin、Claudin-1和β-action的抗體。然后,將PVDF膜分別與抗鼠IgG-HRP抗體和抗兔IgG-HRP抗體在室溫下孵育2 h。使用Tanon 5200全自動化學發光成像分析系統對蛋白條帶進行可視化處理,再使用Quantity-One軟件進行分析。

1.2.6 Caco-2細胞中SULT和UGT含量的測定 用濃度為50 μL/mL的腸道菌群培養上清液孵育Caco-2細胞24 h。用全蛋白提取試劑盒提取蛋白,Caco-2細胞中SULT和UGT的含量測定均按照ELISA試劑盒中的說明操作,之后用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度(OD)值,計算Caco-2細胞中SULT和UGT的含量。

1.3 數據處理

所有實驗均重復5次,數據以“Mean±SD”的形式表示,用GraphPad Prism 5.01和SPSS 16.0處理數據。

2 結果與分析

2.1 食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞活力值的影響

小鼠灌胃給藥后,其腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞的活力值的影響如圖1所示。

圖1 腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞活力值的影響Fig.1 Effect of intestinal flora culture supernatant on the viability of Caco-2 cells注:*:表示與0 μL/mL時相比差異顯著,P<0.05,**:表示與0 μL/mL時相比差異極顯著,P<0.01。

由圖1可知,當對照組和ZSSP組的腸道菌群培養上清液的濃度為1～50 μL/mL時,與各組0 μL/mL時相比,其細胞活力值沒有顯著性差異(P>0.05),表明在1～50 μL/mL的濃度范圍內,菌液對Caco-2細胞沒有毒副作用。但當濃度達到100 μL/mL時,對照組和ZSSP組的細胞活力值與各組0 μL/mL時相比顯著下降(P<0.05或P<0.01),說明劑量過高,會抑制Caco-2細胞的生長,產生毒性作用。在安全范圍內,選擇所考察的最大劑量對Caco-2細胞進行處理,故選擇50 μL/mL的濃度進行后續實驗。

2.2 食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞中外排轉運蛋白的影響

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多藥耐藥相關蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)都是ATP結合盒式外排轉運蛋白,它們可以利用ATP分解產生的能量進行藥物的跨膜轉運[21]。益生菌乳桿菌中的可溶性因子上調了Caco-2細胞中的外排轉運蛋白的表達水平[22]。這為本實驗提供了腸道菌調節外排轉運蛋白表達的新思路。

為了探究酸棗仁多糖是否能通過腸道菌群參與細胞中外排轉運蛋白的調節,用腸道菌群培養上清液處理Caco-2細胞。由圖2可知,ZSSP組的腸道菌群培養上清液處理Caco-2細胞24 h后,細胞中P-gp、MRP2的表達水平與對照組相比顯著降低(P<0.05)。這表明,食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液可以下調外排轉運蛋白在Caco-2細胞中的表達,酸棗仁多糖可能是通過腸道菌群介導機制發揮其藥理作用。

圖2 50 μL/mL的腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞中P-gp和MRP2蛋白表達的影響Fig.2 Effect of 50 μL/mL intestinal flora culture supernatant on P-gp and MRP2 protein expression in Caco-2 cells注:*:表示與對照組相比差異顯著,P<0.05;圖4同。

2.3 食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞中緊密連接蛋白的影響

藥物可以通過細胞旁途徑進入細胞,而細胞旁途徑就是指特定藥物通過細胞之間的緊密連接進入細胞間隙而被吸收的過程,緊密連接是由Occludin、Claudin-1等組成[23]。緊密連接阻止大分子物質,允許小分子物質和離子通過[24-25]。

由圖3可知,食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液可以微弱的升高Occludin的蛋白表達水平,但不具備顯著性差異(P>0.05)。而對于Claudin-1蛋白的表達來說,ZSSP組與對照組相比有微弱的減少,但同樣不具有顯著性差異(P>0.05)。緊密連接是腸道黏膜屏障的重要組成部分,目前有研究表明益生菌對腸黏膜屏障中的緊密連接蛋白起到保護作用[26],這可能是酸棗仁多糖不能通過腸道菌群介導機制調節緊密連接蛋白表達的原因。

圖3 50 μL/mL的腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞中Occludin和Claudin-1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of 50 μL/mL intestinal flora culture supernatant on occludin and claudin-1 protein expression in Caco-2 cells

2.4 食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞中SULT和UGT含量的影響

磺酸基轉移酶(sulfotransferase,SULT)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)是人體重要的II相代謝酶,可以進行藥物代謝,同時也可以代謝許多重要的內源性物質[27-28]。藥物進入細胞后由II相代謝酶轉化為相關的II相代謝產物,然后由外排轉運蛋白轉運至腸道內腔,從而導致藥物的生物利用度下降[29]。為了探究酸棗仁多糖是否能通過腸道菌群參與細胞中SULT和UGT的調節,用腸道菌群培養上清液處理Caco-2細胞,結果如圖4所示。

圖4 50 μL/mL的腸道菌群培養上清液 對Caco-2細胞中SULT和UGT的影響Fig.4 Effect of 50 μL/mL intestinal flora culture supernatant on SULT and UGT in Caco-2 cells

圖4A和圖4B分別為尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶(UGT)和磺酸基轉移酶(SULT)的實驗結果。由圖4A可知,ZSSP組的腸道菌群培養上清液與對照組相比可以顯著升高UGT在Caco-2細胞中的含量(P<0.05)。由圖4B可知,食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液對SULT在Caco-2細胞中的含量沒有顯著影響(P>0.05)。這表明食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液能增加Caco-2細胞中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶的含量,但對磺酸基轉移酶沒用影響。

3 結論

由于人類自身所產生的酶難以消化大分子的植物多糖,需要腸道中的微生物將其降解,同時腸道微生物對植物多糖的選擇性消化也影響著腸道菌群的多樣性。大量研究表明植物多糖通過腸道菌群介導機制發揮藥理作用,如Fan等[30]發現,冬蟲夏草多糖能夠通過調節腸道微生物,發揮免疫調節作用。Zhang等[8]發現,甘草多糖能夠通過調節腸道菌群的組成,發揮抗腫瘤的作用,抑制BALB/c小鼠體內的腫瘤生長和轉移。

本研究以Caco-2細胞為研究對象,探究了食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液能否影響Caco-2細胞中外排轉運蛋白、緊密連接蛋白的表達水平和Caco-2細胞中Ⅱ相代謝酶的含量。通過MTT法表明,1～50 μL/mL的腸道菌群培養上清液對Caco-2細胞無明顯的毒性作用,選最大濃度50 μL/mL進行后續實驗。運用免疫印跡法探究了Caco-2細胞中外排轉運蛋白和緊密連接蛋白的表達水平。發現食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液能顯著下調Caco-2細胞中外排轉運蛋白P-gp和MRP2的表達水平(P<0.05),但對緊密連接蛋白沒有顯著影響(P>0.05)。運用ELISA的方法,探究Caco-2細胞中Ⅱ相代謝酶的含量,發現其能顯著上調UGT的含量(P<0.05),但對SULT沒有顯著影響(P>0.05)。實驗結果表明,食用酸棗仁多糖的小鼠腸道菌群培養上清液能調節Caco-2細胞中的蛋白表達。酸棗仁多糖可能通過腸道菌群的介導機制發揮調節作用,有可能是酸棗仁多糖經腸道菌群降解后,其本身和代謝產物對Caco-2細胞進行了調節;也有可能是腸道菌群對酸棗仁多糖的選擇性消化,改變了腸道菌群的組成,從而影響了Caco-2細胞中吸收相關蛋白的表達。后續實驗將探究酸棗仁多糖及其代謝產物對Caco-2細胞的影響,并探究酸棗仁多糖對小鼠腸道菌群的組成和短鏈脂肪酸的調節作用。對食用了酸棗仁多糖的C57BL/6小鼠結腸組織進行研究,發現酸棗仁多糖同樣可以影響小鼠結腸組織中的吸收相關蛋白的表達,具體結果將與后續研究一起,另外撰寫一篇文章。

Caco-2細胞被廣泛地應用于藥物吸收的研究,其具有與人小腸上皮細胞形態上的相似,具有相同的細胞極性、緊密連接、Ⅰ相代謝酶和Ⅱ相代謝酶等[31]。大量研究表明,包括II相代謝和外排轉運在內的首過代謝是導致黃酮類化合物生物利用度降低的重要原因。Lu等[32]的研究發現大豆可溶性多糖可以顯著改善大豆染料木黃酮在小鼠體內的吸收,其機制與大豆可溶性多糖能夠下調P-gp、MRP1和MRP2的蛋白表達水平有關。本研究發現喂食酸棗仁多糖小鼠的腸道菌群培養上清液,能夠下調P-gp和MRP2的蛋白表達水平,這為研究酸棗仁多糖提高黃酮類化合物在體內的吸收和生物利用度,提供了理論基礎。