HPLC測定余甘子茶中3種多酚成分及抗氧化活性研究

劉曉麗,楊冰鑫,陳柳青,雷 源,吳克剛

(廣東工業大學輕工化工學院,廣州番禺 511400)

余甘子是一種亞熱帶植物[1],源于緬甸和印度,現在中南半島、印度尼西亞、菲律賓、中國等地均有分布,其中在中國的產量相對較多,被列為我國“藥食同源”的品種之一[2]。余甘子富含多酚、維生素、多糖、有機酸等多種活性物質[3-5],其中最具有特征的成分是多酚,約占余甘子的20%左右,主要有效多酚成分有沒食子酸(Gallic acid,GA)、柯里拉京(Corilagin,CO)、鞣花酸(Ellagic acid,EA)等[6-8]。

近幾年大量文獻報道,余甘子有利肝[9-10]、消炎[11]、降血脂血糖[12-13]、提高機體免疫力[14]、美白[15]、抗糖尿病[16]等生理功效。其中GA、CO和EA的含量常被視為余甘子品質評估的重要指標[17],其具有抗腫瘤、抗氧化等作用[18]。目前,余甘子茶在我國的四川、廣東、云南等地均有銷售,用其泡茶可有效緩解消化不佳、咽喉不適、血液循環不佳等不良反應[19-20]。據報道,余甘子多酚可以作為抗氧化劑替代品運用于食品的抗氧化;將余甘子多酚作為一種天然油脂抗氧化劑應用于餅干的加工;添加余甘子多酚的產品在貯存過程中的過氧化物值和酸價都明顯低于添加人工合成抗氧化劑BHA[21]。余甘子茶中多酚提取方法多樣,溶劑浸提法較為普遍使用,其中用乙醇相對于其它溶劑提取效果較佳且無毒。目前在HPLC測定余甘子中多酚活性成分的相關文獻中,主要采用的流動相為磷酸溶液-乙腈,這一流動相下梯度洗脫程序較為復雜且耗時較長[22]。

本論文所采用0.1%三氟乙酸-乙腈解決了這一問題。本實驗用45%乙醇提取余甘子茶多酚,測定總多酚(Total polyphenols,TP)含量,并對不同產地的余甘子茶提取液進行HPLC分析測定余甘子茶中GA、CO和EA的含量,同時比較其抗氧化活性,為余甘子進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子茶 分別購自四川涼山、福建漳州、廣東潮汕、云南昆明、廣西玉林五個不同產地;昆明小鼠許可證號:SCXK(粵)2013-0034 廣州中醫藥大學;無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、無水碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、30%雙氧水、水楊酸 均為分析純,天津市致遠化學試劑有限公司;二甲基亞砜(DMSO) 天津致遠化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,分析純)、鞣花酸(EA)、柯里拉京(CO)、沒食子酸(GA)(標準品) 上海源葉生物科技有限公司;乙腈 色譜純,瑞典Opson;2-硫帶巴比妥酸、福林酚溶液 均為分析純,上海麥克林生化科技有限公司;乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵 均為分析純,天津市大茂化學試劑;水 為高純水。

LC-20A高效液相色譜儀、Inertsil ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱 日本島津;U-1950紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取2 g余甘子茶溶于25 mL的45%乙醇中,在溫度為70 ℃的條件下浸提135 min,過濾,濾渣重復上述操作,合并兩次濾液后旋轉蒸發,濃縮至膏狀,濃縮液用DMSO稀釋到濃度為0.2 mg/mL,0.45 μm的有機微孔濾頭過濾得到濾液。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別稱取一定量的GA、CO、EA,以DMSO為溶劑,配制GA、CO、EA對照品,濃度均為1 mg/mL,0.45 μm的微孔濾頭過濾得到濾液。

1.2.3 TP的測定 參考卜彥花等[23]的福林酚比色法。繪制標準曲線,其中X軸為GA的質量濃度(mg/mL),Y軸為吸光值,得線性方程為:y=0.1431x+0.0791(r=0.9997,1～5 mg/mL),依據標準曲線計算TP含量,用mg 沒食子酸/g余甘子茶表示,計算公式如下:

式中,V:總體積(mL);A:GA濃度(mg/mL);m:樣品質量(g)。

1.2.4 色譜條件 色譜條件[24]:以Inertsil ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱;柱溫為25 ℃,乙腈(A)為0.1%三氟乙酸(B)為流動相流速為1.0 mL/min,進樣量1 μL,在254 nm波長處檢測,梯度洗脫:0～35 min,95%～68%(B)。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 線性關系考察 分別吸取GA、CO、EA溶液,用DMSO梯度稀釋,配制成濃度為 0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg/mL的溶液,充分搖勻,在1.2.4色譜條件測定。X軸為標準樣品的濃度(mg/mL),Y軸為色譜峰的峰面積(104)。

1.2.5.2 精密性實驗 依據1.2.2方法制備的GA、CO、EA溶液,在1.2.4色譜條件下,連續進樣6次,計算GA、CO、EA峰面積的標準偏差(RSD)。

1.2.5.3 穩定性實驗 依據1.2.1方法制備涼山的余甘子茶提取液,參照1.2.4色譜條件對同一樣品在0、2、4、8、10、24 h分別測定,分別計算GA、CO、EA含量的RSD。

1.2.5.4 重復性實驗 參照1.2.1方法平行制備6份涼山的余甘子茶提取液,在1.2.4色譜條件下,分別計算GA、CO、EA含量的RSD。

1.2.5.5 加樣回收率實驗 按照1.2.1方法制備涼山的余甘子茶提取液,加入0.1 mL不同濃度的GA、CO、EA溶液,參照1.2.4色譜條件,分別計算GA、CO、EA加標回收率。

1.2.5.6 樣品測定 參照1.2.1方法制備的不同產地的樣品溶液,在1.2.4色譜條件,連續進樣3次,分別計算余甘子茶中GA、CO、EA含量。

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定 DPPH清除自由基的測定方法參考文獻[25-26],取3 mL待測液,加3 mL的0.1 mg/mL DPPH-無水乙醇溶液,靜置30 min使其充分反應,4000 r/min離心10 min,于517 nm處測其吸光度,以茶多酚為陽性對照。

式中:A1為樣品上清液的吸光度;A2為樣品加無水乙醇的吸光度;A3為無水乙醇加DPPH溶液的吸光度。

1.2.7 羥自由基清除率的測定 采用水楊酸滴定法[27],取待測樣品2 mL,加9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L的C7H9O3溶液各1 mL,再加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL使其發生顯色反應,在37 ℃的水浴鍋中反應30 min后于510 nm處測其吸光度,以茶多酚為陽性對照。

式中:A1上清液的吸光度;A2為不加H2O2的吸光度;A3為空白液的吸光度。

1.2.8 總還原能力的測定 采用鐵氰化鉀還原法測定[28]。取1 mL待測液,加pH6.6磷酸緩沖溶液和1% K3[Fe(CN)6]溶液各2.5 mL,50 ℃水浴20 min,再加入10% TCA溶液2.5 mL,4000 r/min離心10 min取上清液2.5 mL,加入2.5 mL的去離子水和0.5 mL的0.1% FeCl3溶液,振動混勻后靜置10 min后于700 nm處測吸光度,以茶多酚為陽性對照。

1.2.9 自發性肝脂質氧化的抑制 昆明小鼠處理前禁食禁水12 h,脫臼處死,取其肝臟,用組織搗碎機進行搗碎,混于生理鹽水制成5%(m/v)的肝勻漿。采用硫帶巴比妥酸顯色法[29]進行檢測,向1 mL 5%肝勻漿中0.32 mL余甘子茶提取液,37 ℃水浴1.5 h,加入1 mL的EDTA和TCA的混合液(EDTA的濃度為0.1%,TCA的濃度為10%),4000 r/min離心10 min,再加入1 mL的0.67% TBA,沸水浴30 min,在532 nm處測吸光值A2,以加去離子水為空白對照,測得吸光值為A1,以茶多酚為陽性對照。肝脂質氧化抑制率的計算公式為:

表2 加樣回收率試驗Table 2 Recovery test of sample loading

式中:A1為樣品上清液的吸光度;A2為空白對照的吸光度。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 余甘子TP含量

福林酚法測余甘子茶中TP含量的結果見圖1,TP含量最高的是涼山的余甘子茶為228 mg/g,最低的是漳州產地為107 mg/g。

圖1 不同產地的余甘子中TP的含量Fig.1 Total polyphenol content in Phyllanthus emblica L.in different producing areas

2.2 對照品和余甘子樣品的HPLC色譜

從HPLC圖能夠得出,在1.2.4色譜條件下,余甘子茶提取液色譜圖中GA、CO、EA 3個目標峰的分離效果較好,而且各產地樣品的目標峰出峰時間與GA、CO、EA出峰時間一致。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系 GA、CO、EA的線性方程、相關系數見表1。在線性范圍內,相關系數r均大于0.999,各個標準品的峰面積和濃度之間的線性關系良好。

表1 對照品的線性方程Table 1 Linear equations for control article

2.3.2 精密度實驗 GA、CO、EA峰面積的RSD依次為2.52%、2.49%、1.02%,表明儀器有較好的精密度。

2.3.3 穩定性實驗 余甘子茶中GA、CO、EA含量的RSD依次為1.38%、2.30%、2.47%,表明在室溫條件下,余甘子茶提取液在1 d內穩定性良好。

2.3.4 重復性實驗 余甘子茶中GA、CO、EA含量的RSD依次為1.78%、2.66%、2.36%,表明該方法重復性優良。

2.3.5 加樣回收率實驗 余甘子茶中GA、CO、EA的加標回收率依次為96.82%、97.69%、95.84%,RSD依次為0.48%、0.67%、1.23%。表明方法有較好的回收率且回收結果精確可靠。

2.4 5個產地的余甘子茶提取物中GA、CO、EA含量HPLC方法測試不同產地的余甘子茶中GA、CO、EA含量的結果見表3。在GA、CO、EA三種多酚中,余甘子茶多酚中CO的含量最高,在10 mg/g以上,GA和EA的含量在1～6 mg/g。漳州的余甘茶中GA、CO、EA的含量(5.00、28.76、4.30 mg/g)均高于涼山、昆明、潮汕、玉林產地的余甘茶,玉林的余甘茶中GA和CO最低分別為1.21、13.16 mg/g,昆明的余甘茶中EA含量最低為1.91 mg/g。GA含量從高到低產地依次為:漳州、昆明、涼山、潮汕、玉林;CO含量從高到低產地依次為:漳州、涼山、昆明、潮汕、玉林;EA含量從高到低產地依次為:漳州、潮汕、玉林、涼山、昆明。由此推斷,余甘子茶中GA、CO、EA的含量不同可能與余甘子茶的生長地域有關。

圖2 對照品和余甘子提取物的HPLC色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of control and Phyllanthus emblica L.extracts注:1、GA;2、CO;3、EA;4、涼山;5、潮汕;6、昆明;7、玉林;8、漳州;A、GA;B、CO;C、EA。

表3 不同產地的余甘子茶提取物中GA、CO、EA含量Table 3 Contents of GA,CO and EA in ethanol extracts of Phyllanthus emblica L.from different origins

2.5 自由基清除率

2.5.1 不同產地的樣品對DPPH·的清除能力 不同產地的樣品對DPPH·的清除能力結果見圖3。余甘子茶提取物中主要以酚類物質為主,酚類物質中的酚羥基提供電子和DPPH·中的孤對電子有效結合,進而清除DPPH·。當樣品濃度為6～62 μg/mL范圍內,各產地樣品對DPPH·的清除能力隨著濃度逐漸增加,漳州的余甘子茶提取液清除能力較差,EC50為24.10 μg/mL,而昆明、玉林、涼山的余甘子茶提取液對DPPH·的清除能力差異不顯著(P>0.05),EC50依次為7.25、7.26、7.46 μg/mL。

圖3 不同產地的余甘子茶提取物對DPPH自由基的清除率Fig.3 Inhibitory effects of ethanol extracts of Phyllanthus emblica L.from different habitats on DPPH free radicals

2.5.2 不同產地的樣品對·OH的清除能力 不同產地的樣品對·OH的清除能力結果見圖4。余甘子茶提取物的酚羥基作為供電子基團與具有極強吸電子能力的·OH結合,清除·OH。在對·OH清除能力的比較中,當樣品濃度在0.4～2 mg/mL范圍內時,各產地樣品對·OH的清除能力隨著濃度逐漸增加,漳州的余甘子茶提取液的清除能力較差,EC50為0.83 mg/mL,涼山的則最好,EC50為0.44 mg/mL;綜上所述,在5個不同產地的樣品中涼山的余甘子茶提取液對DPPH·和·OH的清除效果較好,漳州較差。

圖4 不同產地的余甘子茶提取物對羥基自由基的清除率Fig.4 Inhibitory effect of ethanol extracts of Phyllanthus emblica L.from different habitats on hydroxyl radicals

2.5.3 不同產地樣品和標準品對自由基清除能力的EC50不同產地樣品和標準品對自由基清除能力的EC50結果見表4。測定GA、CO、EA對DPPH·清除能力,標準品相比于其它產地的余甘子茶,GA和CO相對較好;在被檢測的9個樣品中GA抑制效果最好，EC50為1.06 μg/mL,茶多酚最差。測定GA、CO、EA對·OH清除能力,相比于其它產地余甘子茶,CO和EA相對較好;在被檢測的9個樣品中CO清除效果最好，EC50為0.23 mg/mL,GA最差，EC50為8.98 mg/mL。

表4 各樣品自由基清除率的EC50Table 4 EC50 of free radical scavenging rate of each sample

2.6 總還原能力

總還原能力可以解釋物質抗氧化活性的原理,作為抗氧化能力評價的指標之一[30]。余甘子茶提取物中的酚羥基將K3[Fe(CN)6]中的Fe3+還原成Fe2+,亞鐵氰化鉀和三氯化鐵在酸性條件下生成亞鐵氰化鐵,在700 nm處有吸收峰,由于不同產地的余甘子茶提取液中多酚含量不同,其吸光值也相同,因此對不同產地的余甘子茶提取物的總還原能力進行比較。各產地余甘子茶提取物的總還原能力見圖5。當各樣品濃度為0.2～1 mg/mL,隨樣品濃度增加,總還原能力也呈上升趨勢,其中以昆明的余甘子茶提取液總還原能力最強,涼山產地相對較差。

圖5 總還原能力Fig.5 Total reduction capability

2.7 自發性肝脂質氧化抑制

肝脂質氧化產生大量的丙二醛及其它醛類物質,丙二醛可與TBA生成有色化合物在532 nm處有吸收峰。各不同產地的余甘子茶提取液對自發性肝脂質氧化的抑制率見圖6。不同產地的余甘子茶提取液對自發性肝脂質氧化抑制能力不同,但差異不顯著(P>0.05),其中涼山州產地的余甘子茶提取液對自發行肝脂質氧化抑制能力效果最高,各產地的余甘子茶提取液對自發性肝脂質氧化的抑制能力強于茶多酚。

圖6 不同產地的余甘子茶提取液 對自發性肝脂質氧化的抑制率Fig.6 The inhibition rate of the extract of Phyllanthus emblica L.in different places on the spontaneous hepatic lipid oxidation注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05。

2.8 相關性分析

通過SPSS進行相關性分析,得出活性成分的含量與抗氧化活性的EC50值的相關系數,結果見表5。各活性成分的含量與抗氧化活性的指標具有相關性,且均為正相關。CO的含量和 DPPH·的清除能力相關性極顯著(P<0.01),相關系數為0.964,EA的含量和DPPH·的清除能力顯著相關(P<0.05),相關系數為0.933;與·OH的清除能力相關性最大的是EA的含量,與總還原能力相關性最大的是GA的含量,GA含量與自發性肝脂質氧化抑制能力具有顯著相關性(P<0.05);在這四個活性成分的指標中對抗氧化活性的貢獻依次為:CO>EA>GA。多酚具有抗氧化活性主要是因為多酚中含有酚羥基,酚羥基具有還原性,通過自身被氧化從而達到抗氧化的效果,其抗氧化活性的大小與多酚中有效酚羥基的數目之間呈正相關[31],GA、CO、EA三種活性多酚中酚羥基的個數依次為:CO>EA>GA,這與四個指標對抗氧化活性貢獻大小的結果是一致的。

表5 活性成分含量與抗氧化活性之間的相關系數(r)Table 5 Correlation between active ingredients and antioxidant activity

3 結論

本實驗建立了測定余甘子茶中GA、CO、EA含量的方法,該方法簡捷、精準、穩定且重復性好,可用于評價余甘子茶的質量。同時測定了5個產地的余甘子茶中的GA、CO、EA的含量,其中GA的含量以漳州(5.00 mg/g)最高,玉林(1.21 mg/g)最低;CO的含量以漳州(28.76 mg/g)最高,玉林(13.16 mg/g)最低;EA的含量以漳州(4.30 mg/g)最高,昆明(1.91 mg/g)最低。

余甘子茶提取物抗氧化活性研究結果表明,涼山產地樣品對DPPH·和·OH的抑制效果較好,漳州的最差;昆明產地樣品的總還原能力最好,涼山的最差。余甘子茶中的GA、CO、EA含量與抗氧化活性具有相關性,對抗氧化活性的貢獻依次為:CO>EA>GA;其中CO的含量和DPPH·的清除能力相關性極顯著(P<0.01,r=0.964),EA的含量和DPPH·的清除能力相關性顯著(P<0.05,r=0.933),GA的含量與自發性肝脂質氧化抑制能力相關性顯著(P<0.05,r=0.895)。實驗結果發現各產地的余甘子茶對肝脂質氧化抑制的能力強于茶多酚,為開發出一種新型保肝藥品提供科學依據。同時余甘子茶的抗氧化活性研究為余甘子作為抗氧化劑替代品用于食品的抗氧化,以及進一步開發為功能性食品的添加物提供了理論依據。