植物乳桿菌ZU018增殖培養基的優化

金玉潔,何國慶

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)屬于乳桿菌科乳桿菌屬,是一種同型發酵乳酸菌,革蘭氏染色呈陽性,不產芽孢,且兼性厭氧,具有很強的發酵碳水化合物的能力,較耐鹽、耐酸[1]。其最適生長溫度為30～35 ℃,最適pH在6.5左右,在MRS培養基中菌落形態均為白色圓形凸起菌落,有大有小。植物乳桿菌作為一種重要的益生菌,具有改善食品風味[2]、增強免疫力[3]、調節腸道健康[4]、降低膽固醇[5]、改善焦慮抑郁[6]等功能,在食品發酵、工業發酵及醫療保健等領域都有著廣泛的應用。獲得高密度植物乳桿菌對其商業化生產具有重要作用。

高密度培養是一個相對的概念,通過一定的培養技術和裝置使得菌體的發酵密度較普通培養有顯著性提高,從而提高特定產物的生產率[7]。影響植物乳桿菌生長的因素有很多,如菌種活力、培養代數、培養周期、培養基、培養溫度以及接種量等[8]。植物乳桿菌的高密度培養一般采用補料、膜過濾、細胞固定化等方式來減少代謝廢物對植物乳桿菌生長的抑制,提高菌體密度,但這些方法往往較為復雜且成本較高[9]。相比來說,培養基的成分優化獲得高密度細胞是最為經濟、有效的途徑。梁璋成等[10]采用均勻設計及正交試驗優化植物乳桿菌R23培養基,結果顯示在培養基中引入蘋果酸鈉,增菌效果明顯。蔡麗麗等[11]利用響應面法對植物乳桿菌培養基成分中的碳源、緩沖溶劑、氮源進行了優化,確定最終菌液光密度 OD600最大為 2.0577。郝永偉等[12]對植物乳桿菌高效培養基碳源進行優化后發現蔗糖能部分替代葡萄糖作為碳源,節約了成本。

根據植物乳桿菌的生長特點,本文探究了培養基成分對植物乳桿菌生長繁殖的影響,確定了優化培養基配方,提高植物乳桿菌的菌體密度,為今后植物乳桿菌高密度發酵提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ZU018 由浙江大學生物系統工程與食品科學學院食品微生物實驗室篩選并鑒定,于15%(V/V)甘油的MRS培養基中-80 ℃凍存,保藏編號為J-180312;MRS液體培養基 蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、酵母浸粉4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L,吐溫80 1.0 mL,pH6.2～6.4,用蒸餾水定容至1000 mL,121 ℃滅菌15 min;MRS固體培養基 MRS液體培養基中加入質量濃度為1.5%～2%的瓊脂粉,121 ℃滅菌15 min,用于活菌計數;基礎培養基 MRS培養基根據實驗設計調整各組成分的種類及含量。

Multiskan GO全波長酶標儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;LRH-250生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;BSA124S電子天平、PB-10 pH計 德國Sartorius;YXQ-LS-50 SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司;UPR純水儀 西安優普(Ulupure)儀器設備有限公司;SW-CJ-1D超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將甘油凍存的菌種劃線于MRS固體培養基上,37 ℃培養24 h后挑取單菌落于MRS液體培養基中,靜止培養24 h。再以2%的接種量接種于MRS液體培養基中,活化兩代,即得實驗用活化菌種。

1.2.2 活菌數的測定 發酵液中活菌數的測定采用稀釋平板計數法,參照陳燕飛[13]的方法。

1.2.3 發酵培養基成分優化

1.2.3.1 單因素實驗 碳源及添加量:分別以20 g/L的麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、復配比為1∶1的蔗糖和葡萄糖(m/m)、D-果糖、山梨醇替換基礎培養基中的碳源,2%接種量,37 ℃下培養18 h,測定活菌數,確定最佳碳源;將最佳碳源分別以10、15、20、25、30 g/L的濃度加入到基礎培養基中,2%接種量,37 ℃下培養18 h,測定活菌數,確定最佳添加量。

氮源及添加量:分別以20 g/L的大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉替換基礎培養基中的氮源,2%接種量,37 ℃下培養18 h,測定活菌數,確定最佳單一氮源;在此基礎上,將其他有機氮源分別與最優單一氮源進行復配,復配比為1∶1 (m/m),2%接種量,37 ℃下培養18 h,測定活菌數,確定最佳復合氮源;將最佳氮源分別以20、30、40、50、60 g/L的濃度加入到基礎培養基中,2%接種量,37 ℃下培養18 h,測定活菌數,確定最佳添加量;在最佳氮源及添加量的基礎上,選擇1∶2、1∶1、2∶1的氮源復配比配制培養基,2%接種量,37 ℃下培養18 h,測定活菌數,確定最佳復配比。

1.2.3.2 部分因子實驗設計(Fractional factorial design,FFD) 相關研究表明,磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸三銨作為培養基中的緩沖鹽,與細胞生物量密切相關[7],因此,在單因素實驗所篩選出的碳源和氮源的基礎上,選取磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸三銨為緩沖鹽,采用部分因子實驗初步確定培養基中的這些組分對植物乳桿菌ZU018生長影響最為重要的三個因素,根據單因素實驗結果,應用Design Expert 10軟件對培養基組分進行部分因子實驗設計,如表1所示。

表1 部分因子實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of FFD

1.2.3.3 最陡爬坡路徑實驗(Path of steepest ascent) 基于1.2.3.2篩選出對活菌數影響顯著的因素,對實驗數據平均值與中心點試驗數據的平均值進行方差分析檢驗,若結果表明不顯著,這說明最優點不在實驗范圍之內,需進行最陡爬坡實驗,通過各顯著因素的正負效應來確定最陡爬坡試驗的路徑(包括變化方向及變化步長),快速的逼近最大響應區域[14],其中,顯著影響因素以部分因子實驗設計的0水平為基礎步移[15]。

1.2.3.4 Box-Behnken Design試驗(BBD) 基于1.2.3.2與1.2.3.3,進行Box-Behnken設計試驗,以部分因子實驗篩選得到的對植物乳桿菌ZU018活菌數具有顯著影響的因素作為設計因子,以最陡爬坡路徑試驗活菌數最多時的變量值作為中心點,對實驗結果進行響應面分析,實驗因素及水平如表2所示。

表2 Box-Behnken中心組合試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of BBD

為了驗證模型預測值與實際值之間的偏差,利用優化培養基對植物乳桿菌ZU018進行培養,測定最終活菌數。

1.3 數據處理

所有試驗數據均重復三次。采用Design Expert 10.0設計軟件進行實驗設計,并對試驗數據作回歸分析;采用SAS(Version9.4)統計軟件進行顯著性差異分析,P<0.05即認為存在顯著性差異;采用Origin8.5.1軟件進行繪圖,采用Microsoft Excel 2016軟件進行數據計算。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 培養基成分的優化

2.1.1.1 不同碳源對植物乳桿菌ZU018生長的影響 合適的碳源有利于細胞的吸收和利用,加快微生物增殖。常見碳源有糖類、低碳醇和油脂等[16],本實驗選取麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨醇為碳源,研究其對植物乳桿菌ZU018生長的影響。

不同碳源的培養基對植物乳桿菌ZU018活菌數的影響具有顯著性差異(P<0.05),如圖1所示。麥芽糖作為碳源時,植物乳桿菌ZU018活菌數最高,達到5.68×109CFU/mL。果糖及山梨醇作為碳源時,活菌數較低。張巖春等[17]發現果糖為促進植物乳桿菌C88生長最為合適的碳源,劉香英等[18]發現當葡萄糖與蔗糖的比例為1∶1時,有利于植物乳桿菌K25的生長,但本實驗中果糖、蔗糖等對植物乳桿菌ZU018的增殖并無明顯優勢,麥芽糖更符合植物乳桿菌ZU018的生長需要。初步確定麥芽糖作為植物乳桿菌ZU018的碳源。

圖1 不同碳源對植物乳桿菌ZU018生長的影響Fig.1 Effect of different carbon source on the growth of Lactobacillus plantarum ZU018注:不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.1.2 碳源濃度對植物乳桿菌ZU018生長的影響 如圖2所示,隨著麥芽糖濃度的增加,植物乳桿菌ZU018的活菌數逐漸增加,當濃度達到25 g/L時,活菌數最大,達到5.74×109CFU/mL,麥芽糖的濃度增加到30 g/L,活菌數反而有所下降,這可能是因為過高的糖濃度會導致培養環境偏酸性化,從而抑制了植物乳桿菌ZU018的生長[19]。選擇以25 g/L的麥芽糖為植物乳桿菌ZU018的碳源。

圖2 碳源濃度對植物乳桿菌ZU018生長的影響Fig.2 Effect of concentration of carbon source on the growth of Lactobacillus plantarum ZU018

2.1.1.3 不同氮源對植物乳桿菌ZU018生長的影響 不同環境中的乳酸菌具有菌株和環境特異的氮代謝系統,氮源的利用是制約乳酸菌生長的關鍵因素[20]。不同種類的氮源經過不同的水解工藝后,會產生不同組成的氨基酸、寡肽和多肽,此外,有機氮源往往還會含有少量的糖類、脂肪、無機鹽、維生素及某些生長因子,更能促進微生物的生長[21]。本實驗選取大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉和牛肉浸粉為氮源,研究其對植物乳桿菌ZU018生長的影響。

不同氮源的培養基對植物乳桿菌ZU018活菌數的影響具有顯著性差異(P<0.05),如圖3A所示。酵母浸粉作為氮源,活菌數最高,此外,牛肉浸粉作為氮源也能獲得較高的活菌數。朱奇奇等[22]分析了5種有機氮源對植物乳桿菌I4菌體密度的影響,其結果也表明酵母浸粉最適宜該菌的增殖培養。

圖3 不同氮源對植物乳桿菌ZU018生長的影響Fig.3 Effect of different nitrogen source on the growth of Lactobacillus Plantarum ZU018

與單獨使用有機氮源培養植物乳桿菌ZU018相比,多數使用有機混合氮源進行培養的實驗組,活菌數有所增加,如圖3B所示,這與韓爽等[23]的研究結果相似。以牛肉浸粉和酵母浸粉作為混合氮源培養時,活菌數最高,達到6.58×109CFU/mL,且高于僅以牛肉浸粉或酵母浸粉作為單一氮源。初步確定以復配比為1∶1 (m/m)的牛肉浸粉和酵母浸粉作為植物乳桿菌ZU018的氮源。

2.1.1.4 氮源濃度對植物乳桿菌ZU018生長的影響 氮源濃度對菌體生長、產物和副產物的代謝均有著重要影響[24]。氮源含量過低,菌體生長會因營養不足受到影響;氮源含量過高,則會使微生物生長過快,容易導致細胞老化和自溶[25]。合適的氮源濃度對菌體生長至關重要。如圖4A所示,隨著氮源總量的增加,活菌數也逐漸增加,復合氮源濃度為50 g/L時,活菌數最高。

表4 部分因子實驗回歸分析結果Table 4 Regression results of FFD

圖4 氮源濃度及復配比對植物乳桿菌ZU018生長的影響Fig.4 Effect of concentration of nitrogen source and compounding ratio on the growth of Lactobacillus plantarum ZU018

同時,復合氮源的比例對乳酸菌的生長也有一定的影響[26],以不同復配比例的復合氮源對植物乳桿菌ZU018進行培養,其結果如圖4B所示,當氮源復配比例為1∶1時,活菌數顯著(P<0.05)高于氮源復配比為1∶2或2∶1的實驗組,達到8.31×109CFU/mL。有研究表明酵母浸粉成本高,不能在大規模發酵中使用,故而可增加其他氮源減少酵母浸粉的用量[27]。本實驗以牛肉浸粉與酵母浸粉進行復配,豐富蛋白營養成分、可溶性強,有利于植物乳桿菌的生長代謝。選擇以50 g/L復配比為1∶1的牛肉浸粉和酵母浸粉作為植物乳桿菌ZU018的氮源。

2.1.2 部分因子實驗設計 以植物乳桿菌ZU018活菌數(Y)為響應值,選擇單因素實驗選出的碳源(麥芽糖)和氮源(牛肉浸粉和酵母浸粉)以及緩沖物質(乙酸鈉、檸檬酸三銨、磷酸氫二鉀)共6個因子作為篩選因素,每個因子分別確定高(+1)和低(-1)兩個水平,另設3個為零水平實驗用于誤差估計,共進行19次試驗以確定每個因子的影響水平,實驗設計及結果如表3所示。

表3 部分因子實驗設計與結果Table 3 Fractional factorial design and its experimental results

運用Design Expert 10軟件,對表3的實驗結果進行回歸分析,并進行方差檢驗,結果如表4所示,P值為0.0004,小于0.05,表明該擬合模型顯著。影響植物乳桿菌ZU018生長的主次順序為:X3>X1>X5>X6>X4>X2,選取影響最為顯著的X1(麥芽糖)、X3(酵母浸粉)、X5(檸檬酸三銨)為后續最陡爬坡實驗的影響因子;此外,根據表4中回歸系數的大小和符號,確定X1(麥芽糖)、X3(酵母浸粉)、X5(檸檬酸三銨)此三個顯著因素對應的系數均為正,呈現為正效應。

2.1.3 最陡爬坡路徑實驗 由部分因子實驗結果可知,牛肉浸粉和磷酸氫二鉀對植物乳桿菌ZU018活菌數均無顯著影響,這些值保持不變,麥芽糖、酵母浸粉、檸檬酸三銨有顯著正效應,應增加其濃度[28],最陡爬坡路徑設計及結果如表5所示,處理4對應的活菌數(Y值)達到最大值10.12×109CFU/mL。將處理4選作后續試驗的中心點。

表5 最陡爬坡路徑實驗設計與結果Table 5 Path and its experimental result of steepest ascent

2.1.4 Box-Behnken中心組合 根據部分因子實驗和最陡爬坡路徑實驗的結果,初步確定最適中心值為:麥芽糖31.00 g/L、酵母浸粉31.00 g/L、檸檬酸三銨3.20 g/L,取此三個因子為實驗因素,以植物乳桿菌ZU018活菌數(Y值)作為響應值,進行Box-Behnken中心組合試驗,設計及結果如表6所示。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and its experimental results of Box-Behnken

運用Design Expert 10軟件對實驗數據進行分析。以植物乳桿菌ZU018活菌數作為響應值,對結果進行多元回歸分析,建立回歸方程:

Lg(Y)=1.00-0.004458A+0.036B+0.022C+0.004337AB-0.002326AC+0.017BC-0.022A2-0.035B2-0.005352C2。

對上述回歸方程模型進行方差分析如表7所示,結果表明,所選用的二次多項式模型高度顯著性(P<0.001),與實際情況擬合良好。其中實驗因素B(酵母浸粉)、實驗因素C(檸檬酸三銨)對植物乳桿菌ZU018活菌數影響極顯著(P<0.001),而A(麥芽糖)對其的影響較小。同時三個因素之間的兩兩交互作用中,BC(即酵母浸粉與檸檬酸三銨)的交互作用對植物乳桿菌ZU018的活菌數影響極顯著。

表7 Box-Behnken設計方差分析表Table 7 ANOVA results of BBD

根據Design-Expert 10軟件得到的回歸分析結果如圖5所示,回歸模型存在最大值,一次項B、C極顯著,二次項A2、B2極顯著,交叉項BC極顯著;此外,麥芽糖和酵母浸粉、麥芽糖和檸檬酸三銨的交互作用較小,近似圓形:該回歸模型得出Box-Benhnken試驗設計的最優結果為麥芽糖30.03 g/L、酵母浸粉37.50 g/L、檸檬酸三銨4.39 g/L,在此優化條件下的活菌數為10.96×109CFU/mL。

圖5 麥芽糖、酵母浸粉和檸檬酸三銨交互作用對植物乳桿菌ZU018生長影響的響應面圖Fig.5 Response surface of effect of maltose,yeast extract and triammonium citrate interaction on growth of Lactobacillus plantarum ZU018

為了檢驗模型優化結果的準確性,按優化的結果配制培養基進行發酵試驗,設置平行組,3次試驗結果的平均活菌數為10.67×109CFU/mL,和模型預測值接近,驗證了此模型的準確性。優化后最終活菌數比優化前的1.82×109CFU/mL提高4.86倍。

3 結論

通過單因素實驗對培養基中碳源、氮源的研究,得到培養基的最佳碳源為麥芽糖,最佳氮源為復配比為1∶1的酵母浸粉和牛肉浸粉;通過中心組合實驗得到影響植物乳桿菌ZU018活菌數的最主要因素為:麥芽糖、酵母浸粉、檸檬酸三銨;通過最陡爬坡路徑試驗得到了響應面設計因素水平的中心點:麥芽糖31.00 g/L、酵母浸粉31.00 g/L、檸檬酸三銨3.20 g/L;通過響應面優化設計實驗得到最佳優化培養基配方為:麥芽糖30.03 g/L、酵母浸粉37.50 g/L、牛肉浸粉25.00 g/L、檸檬酸三銨4.39 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、乙酸鈉5.00 g/L、硫酸鎂 0.20 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、吐溫80 1.00 g/L。最終發酵液中植物乳桿菌ZU018活菌數相比優化前提高4.86倍,達到10.67×109CFU/mL。本研究植物乳桿菌菌體濃度有顯著提高,為今后植物乳桿菌ZU018的擴大培養和制備高活性乳酸菌發酵劑提供了理論基礎和參考依據。