淋巴瘤來源外泌體的提取方法比較與鑒定

陳珍珍 謝亞萍 施鵬飛 高大泉 譚俊峰 陳況 劉利蓉 黃細蓮 徐穎 錢申賢

外泌體是幾乎所有細胞都能分泌的納米級膜狀囊泡，由脂質雙分子層及嵌在膜上的跨膜蛋白組成，其內包裹來源細胞的信息分子（蛋白質、mRNA和miRNA等）[1]。外泌體是一個直徑在30～100 nm的異質性群體。它作為一種自然載體，在來源細胞與靶細胞間起著信息交流的紐帶作用，能轉運多種生物成分，如脂類、蛋白質、RNA、miRNA、DNA片段等[2-3]。不同類型細胞來源的外泌體攜帶著特異性的標志物，在臨床診斷、疾病篩查、疾病治療等方面具有重要作用[4]。因此，研究外泌體的組成成分及其特征對于探索腫瘤、神經退行性疾病、免疫功能障礙等疾病治療的新策略具有重要意義。但是，外泌體是一種獨特的轉運載體，其形成和作用機制尚存在爭議，目前仍無準確、完整的定義，而提取更是復雜[5-6]。提取外泌體的方法很多，但對幾種提取方法的比較研究目前報道較少。因此，本研究對常用的3種方法以及提取到的外泌體生物學特征進行了比較，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞株 小鼠B淋巴瘤細胞株A20、人Burkkit淋巴瘤細胞株Raji、人臍靜脈內皮細胞株HUVEC購自美國模式培養物集存庫（ATCC）；人彌漫大B淋巴瘤細胞株 OCI-LY3（DLBCL-nonGCB）和 SU-DHL-16（DLBCL-GCB）由浙江省中醫院顧建友教授惠贈。所用細胞株經武漢大學中國典型培養物保藏中心短串聯重復序列鑒定。

1.2 試劑和儀器 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）購自美國Sigma-Aldrich公司，exoEasy試劑盒購自德國Qiagen公司，細胞裂解緩沖液購自美國Cell Signaling公司，RIPA裂解液、考馬斯亮藍快速染色液購自中國碧云天生物技術有限公司，二奎啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒購自中國生工生物工程（上海）有限公司，CD63、CD81、Cyto-c、ALIX、TSG101 抗體購自美國 Abcam公司。超高速離心機購自美國Beckman Coulter公司，一次性抽濾器（0.8 μm）購自美國Millipore公司，透射電子顯微鏡（以下簡稱電鏡）購自日本JEOL公司，凝膠圖像分析系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3 外泌體提取方法

1.3.1 收集細胞上清液 所有細胞株的培養基中加入雙抗，置于37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養。每1～2 d傳代換液。準備提取細胞上清液中的外泌體時，收集處于生長狀態良好的細胞，預先換用無外泌體血清的培養基培養細胞48 h后收集上清液。

1.3.2 PEG沉淀法提取外泌體 取細胞上清液，500 g離心5 min，去沉淀物；再2 000 g離心10 min，去細胞碎片；加入1倍體積配置的PEG，充分混勻，4℃孵育2 h；3 000g離心10 min，1 h后收集沉淀物。將沉淀物重懸于PBS中，使用略低濃度的PEG再次聚沉或通過小體系超速離心進一步純化外泌體。

1.3.3 exoEasy試劑盒提取外泌體 取細胞上清液，先用0.8 μm孔徑的濾頭過濾，去除細胞、細胞碎片、凋亡小體等；再用試劑盒中溶液與細胞上清液等量上下顛倒混勻、離心過柱，用洗脫液將外泌體從柱上洗脫下來備用。

1.3.4 超速離心法提取外泌體 取細胞上清液，500 g離心5 min，去沉淀物；2 000 g離心10 min，去細胞和細胞碎片；然后依次經0.45、0.22 μm帶有聚偏二氟乙烯膜濾膜的濾頭過濾；再經超高速離心機100 000 g、4℃離心70 min，收集沉淀物。用PBS洗滌沉淀物，120 000 g離心70 min，最后用PBS重懸沉淀物。

1.4 外泌體形態學觀察 （1）切片法：PEG沉淀法提取的外泌體用切片法進行形態學觀察。外泌體用PBS洗滌2次，最后1次洗滌前將外泌體懸液轉入1.5 ml EP管中。小心吸干上清液，沿EP管壁緩慢加入2.5%戊二醛，將樣品放入4℃冰箱固定過夜。次日用吸管吸盡樣品固定液，沿管壁小心緩慢加入1 ml PBS并漂洗樣品3次，10 min/次；再用 1%鋨酸溶液固定 1 h，PBS漂洗3次，10 min/次。隨后用5種濃度（30%、50%、70%、90%、100%）的乙醇溶液依次對樣品進行脫水處理，每種濃度脫水15～20 min。脫水完畢吸盡乙醇，加入1 ml純丙酮處理20 min。用包埋劑和丙酮體積比1∶1的混合液處理樣品2 h。然后用純包埋劑處理樣本過夜，70℃加熱固化聚合過夜，用超薄切片機將樣品切成70～90 nm切片，用檸檬酸鉛溶液、醋酸雙氧鈾和50%乙醇飽和溶液依次染色15 min。在電鏡下觀察處理好的樣品。（2）負染法：3種方法提取的外泌體均用負染法進行形態學觀察。事先用PBS將外泌體稀釋到最佳觀察濃度，懸液滴在銅網上，2 min后用濾紙吸干，再滴一滴醋酸雙氧鈾到銅網上，負染3 min，用濾紙吸干多余液體，室溫晾干后在電鏡下觀察拍照。

1.5 外泌體蛋白表達及分布檢測 采用Western blot法。將提取的外泌體經細胞裂解液或RIPA裂解液處理，提取蛋白上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測濃度后進行高溫煮沸變性；變性后的蛋白經上樣、垂直電泳，電轉移、封閉、一抗和二抗孵育，然后顯影，即得到不同蛋白表達的電泳圖。提取的外泌體經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后進行考馬斯亮藍染色，可得到蛋白分布圖。

2 結果

2.1 PEG沉淀法提取的外泌體形態學觀察及蛋白分布特點 在電鏡下，PEG沉淀法提取的外泌體負染后呈圓形或橢圓形的囊泡狀結構，見圖1a。利用切片法處理外泌體標本，見圖1b-d；在不同放大倍數條件下觀察到有零星散在單個分布的外泌體，但更多的是聚集成群。在電鏡下，清晰可見PEG包裹大量的外泌體進而形成外泌體聚合物；外泌體呈現明顯的雙層膜結構，似茶托狀；外泌體的粒徑大小與文獻報道（30～150 nm）一致[8]。

在PEG沉淀法提取的A20外泌體中，Western blot法檢測到標志性蛋白四跨膜家族成員CD63表達且較細胞中更多，同時表達CD81、熱休克蛋白HSP-70、GAPDH，但不表達胞質蛋白Cyto-C，見圖2。這表明PEG沉淀法提取的A20外泌體內容物符合外泌體的經典特征。

圖1 聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的A20外泌體形態學觀察（a：負染法，×80 000；b、c、d：切片法，放大倍數分別為11 500、20 500、44 000倍；透射電子顯微鏡）

圖2 聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的A20外泌體表達特征性蛋白的電泳圖

由蛋白分布圖可見，細胞株的蛋白含量較外泌體豐富，外泌體大部分蛋白集中分布在55～130 kD區域，見圖3。再次使用PEG沉淀法分離提取基礎培養基1640和IMDM可能存在的外泌體，同樣能觀察到類似的蛋白條帶，見圖4。圖中外泌體泳道為PEG沉淀的SU-DHL-16外泌體，與細胞泳道（SU-DHL-16細胞株全蛋白）相比，未檢測到跨膜四分子蛋白CD81、CD63的表達。

圖3 聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的A20外泌體蛋白分布圖

2.2 exoEasy試劑盒提取的外泌體形態學觀察及蛋白分布特點 在電鏡下，exoEasy試劑盒提取的外泌體不易觀察到典型的膜狀結構，平均粒徑偏小，而且背景較臟，雜質較多，視野不清晰，可見大片狀的聚合物，見圖5。

圖4 聚乙二醇（PEG）沉淀法提取的基礎培養基1640和IMDM可能存在的外泌體蛋白分布圖及電泳圖

圖5 exoEasy試劑盒提取多種細胞株來源的外泌體形態學觀察（a：Raji外泌體，×30 000；b：Raji外泌體，×50 000；c：HUVEC 外泌體，×20 000；d：A20 外泌體，×50 000；透射電子顯微鏡）

Western blot檢測發現，exoEasy試劑盒提取的外泌體中CD81、CD63呈弱表達。經考馬斯亮藍染色后，外泌體蛋白條帶變淡且模糊，僅見少數幾個條帶，見圖6；提示exoEasy試劑盒提取的蛋白豐度不高，雜質偏多。

圖6 exoEasy試劑盒提取的A20外泌體蛋白分布圖及電泳圖

2.3 超速離心法提取的外泌體形態學觀察及蛋白分布特點 在電鏡下，可清晰觀察到多種細胞株分泌的外泌體，外泌體呈現經典的茶托狀或類似球體被踩癟的形狀，粒徑約100 nm。外泌體囊泡邊緣可見雙層膜狀結構深染；中央為均質的淡染區，背景清晰，污染物較少；可見外泌體成團聚集的形狀，見圖7。

圖7 超速離心法提取多種細胞株來源的外泌體形態學觀察（a、b：Raji外泌體，×50 000；c：Raji外泌體，×100 000；d：A20 外泌體，×50 000；透射電子顯微鏡）

Western blot檢測發現，超速離心法提取的外泌體中CD63、CD81呈高表達，同時還檢測到與囊泡胞吞作用或囊泡形成相關的蛋白TSG101、ALIX表達，而胞質蛋白Cyto-C不表達，見圖8。提示該方法提取的外泌體最符合典型特征。

經考馬斯亮藍染色后，蛋白條帶呈明顯較強的表達，且不同細胞株的外泌體如OCI-LY3外泌體、HUVEC外泌體有相似的蛋白特征條帶（條帶清晰），提示未受細胞培養基中的雜蛋白干擾，外泌體純度佳，見圖9a。

進一步比較RIPA裂解液或與細胞裂解液處理提取的外泌體蛋白表達情況，發現無明顯區別，Western blot檢測HSP-70蛋白表達也相似，而細胞裂解液處理提取的外泌體蛋白豐度相對高一些，見圖9b-c。提示在對蛋白豐度有要求的實驗中，可選用細胞裂解液處理外泌體；對于外泌體中表達量較高的蛋白，可選用RIPA裂解液或細胞裂解液。

3 討論

淋巴瘤系淋巴組織惡性增殖性疾病，是血液系統中具有高度侵襲性的腫瘤。其臨床表現高度異質性，由于缺乏靈敏度高、特異性好的生物標志物，臨床上對該疾病的診斷與治療存在較大的困難。外泌體是細胞分泌的具有獨特生物學特征的膜性小囊泡，含有大量與來源細胞密切相關的成分。外泌體起源于細胞內的多泡體，胞膜內陷向胞外出芽釋放形成的小囊泡[9]。由于外泌體的膜性結構能阻止蛋白酶等對其攜帶分子的降解，所以通過對淋巴瘤來源外泌體的研究能更好地了解淋巴瘤的疾病特征，并利用外泌體特性為淋巴瘤免疫療法提供新的研究方向，以找到特異性的靶標。然而，對外泌體的分離、提取、純化是研究的前期基礎。

圖9 超速離心法提取的OCI-LY3外泌體、HUVEC外泌體蛋白分布圖及2種裂解液作用的蛋白表達電泳圖（a：TEX1為OCI-LY3外泌體，TEX2為HUVEC外泌體，CELL為OCI-LY3細胞；b、c為OCI-LY3外泌體，LYSIS為細胞裂解液）

目前對于細胞培養上清液或體液（血液、尿液、唾液等）中外泌體成分及功能的研究越來越多，但對于分離提取純度和效率等基礎問題尚未得到很好的解決，且無公認的簡便易行的技術方法?，F在主流的分離提取方法主要有PEG沉淀法、試劑盒提取法、超速離心法等。利用PEG純化和濃縮病毒已有50多年的歷史，是一種相當成熟的手段[7]?；谕饷隗w的生物學特性與病毒相似，用PEG純化病毒的方法嘗試包裹沉淀外泌體[10]。Marton等[11]用PEG法提取了外泌體，并與其他方法提取的外泌體進行比較，發現不同方法提取的外泌體生物學特征沒有差別，并且PEG沉淀法具有經濟、簡便易行、產量高的優勢。試劑盒提取法的應用較多，操作簡便，對儀器設備沒有高要求，但是費用較高。exoEasy試劑盒是利用膜的親和力特性分離外泌體，這種分離方法不是根據外泌體的大小、細胞來源的不同或外泌體表面特異性的表位，而是根據外泌體囊泡的一般生化特性，所以能很好得獲得較完整的外泌體并且快速便捷。然而，目前應用最普遍的是超速離心法，基于外泌體的粒徑大小，通過不同的離心速度去除較小的細胞碎片和體積較大的囊泡[12-13]。超速離心法獲得的外泌體純度較高，但費時、工作量大，效率不高。

本研究對PEG沉淀法、exoEasy試劑盒、超速離心法提取外泌體的生物學特征進行了比較，結果發現PEG沉淀法的提取效率最高，外泌體產量高，外泌體外形特征及標志蛋白能體現外泌體表征。PEG沉淀法同樣提取基礎培養基1640和IMDM同樣觀察到類似于外泌體的蛋白條帶，提示PEG沉淀法可能存在血清雜蛋白的污染，因此提取的外泌體純度不高。這與PEG沉淀法的原理有關，雖然PEG沉淀大大提高了外泌體的產量，但也增加了其他蛋白污染的可能性。PEG沉淀法的外泌體，與細胞株全蛋白的泳道CELL相比，Western blot結果顯示未檢測到跨膜四分子蛋白CD81、CD63的表達。這可能是PEG的包裹作用影響到外泌體表征的穩定體現，提示PEG沉淀法可能會影響到后續外泌體的功能實驗，PEG沉淀法提取的外泌體存在影響提取質量的不穩定因素。exoEasy試劑盒利用非特異性親脂性的原理，只需要較少體積的細胞上清（每次最多32 ml）就能提取到足量的外泌體，簡便易行、時效佳；但是提取到的表征不明顯，CD81、CD63的表達弱，純度低，損耗大。使用此種方法，即使在表征不明顯時，仍能觀察到外泌體表達HSP-70，提示外泌體攜帶表達HSP-70不易受干擾，且HSP-70可能在外泌體中表達量高而易被檢測到。超速離心法雖然費時費力、效率不高，但提取的外泌體表征突出明顯，純度高。因此，可以根據不同的研究目的選擇不同的提取方法。PEG沉淀法適合對外泌體產量需求大的實驗，超速離心法適合外泌體的功能實驗，試劑盒適合外泌體前期預實驗的探索使用。