短期生物炭刺激對紅壤和潮土微生物群落的影響

方明 李潔 賴欣

摘要：通過施用不同質量比的生物炭（0.5%、1.0%、2.0%、4.0%），研究生物炭施用對紅壤和潮土微生物群落結構的影響。通過土柱培養試驗，采用磷脂脂肪酸法測定不同處理土壤微生物的群落結構。添加1.0%、2.0%、4.0%生物炭處理與添加05%生物炭處理相比，潮土細菌PLFAs含量增加了9.5%～56.7%;添加0.5%和1.0%生物炭細菌的磷脂脂肪酸（PLFAs）含量分別顯著降低了33.7%、27.3%;添加0.5%、2.0%、4.0%生物炭處理的革蘭氏陰性細菌PLFAs的含量與單施氮肥處理相比顯著下降了276%～48.8%，生物炭施用對真菌、放線菌、革蘭氏陽性細菌、真菌PLFAs含量和細菌PLFAs含量的比值（真/細）和總PLFAs含量總體沒有顯著影響。生物炭施用對紅壤的微生物PLFAs含量沒有顯著影響。在添加生物炭的處理中，生物炭施用量的增加使飽和脂肪酸含量/不飽和脂肪酸含量有降低的趨勢。通過比值分析、多樣性分析和主成分分析可知，短期生物炭刺激對紅壤和潮土的微生物群落結構沒有顯著影響，2種土壤微生物生態位未產生分化。

關鍵詞：生物炭;紅壤;潮土;土壤微生物;PLFAs;群落結構;主成分分析

中圖分類號： S154.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0250-09

收稿日期：2019-07-08

基金項目：中國農業科學院科技創新工程。

作者簡介：方 明（1992—），男，黑龍江佳木斯人，碩士，主要從事生物炭對土壤碳氮養分循環影響的研究。E-mail：fangmingzhxy@163.com。

通信作者：張貴龍，博士，副研究員，主要從事土壤碳氮循環研究，E-mail：zhangguilong@caas.cn;姜淑苓，碩士，研究員，主要從事果樹學研究，E-mail：jshuling@163.com。 ?菜地土壤的氮肥施用量大，大量的氮素盈余造成了地下水污染、土壤酸化、溫室氣體大量排放等嚴重的環境問題[1]。生物炭作為一種性質穩定的生物質材料，其比表面積和孔隙度較大，含碳量較高，這些性質決定了生物炭具有較高的吸附性、穩定性和養分含量[2]。生物炭能夠提高土壤pH值、土壤的透氣透水性以及固持土壤中的養分等，減少氮素流失，提高作物的氮素利用效率。土壤微生物作為土壤生態系統中的重要組成部分，是土壤氮素循環和轉化的重要驅動力，通過分析土壤微生物的變化情況來探討生物炭對土壤生態系統的作用，是研究生物炭施用益處和風險的途徑之一。

有研究表明，向土壤中添加生物炭后，能夠改變土壤細菌、真菌和古菌的群落組成[3-4]，向黑土中添加生物炭后，土壤細菌阿爾法多樣性（alpha diversity）增加[5]。姚欽利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）法分析了亞馬遜黑土和未改造土壤的細菌和古菌的群落結構，結果表明，富含生物炭的亞馬遜黑土土壤細菌和古菌的群落結構與相鄰未改造土存在顯著差異[6]。PLFAs是細胞膜上的磷脂脂肪酸，其種類的不同可以標記出不同的微生物類群，被廣泛應用在土壤微生物學研究中。Bamminger等通過37 d的培養試驗發現，添加生物炭能顯著提高微生物PLFAs總含量以及細菌類和真菌類PLFAs含量[7]。Steinbeiss等利用磷脂脂肪酸（PLFA）法分析了生物炭施用對土壤4類主要微生物的影響，發現源自酵母的生物炭會促進真菌的生長，而源于葡萄糖的生物炭主要促進革蘭氏陰性細菌的生長[8]。土壤類型影響著生物炭的作用效果[9]。Abujabhah等發現，桉樹生物炭對土壤微生物群落和氮循環細菌的影響主要取決于土壤類型，其中對紅壤和黑土的作用明顯高于棕壤[10]。Liu等施用了0～40 t/hm2 的稻殼生物炭（400 ℃）于紅壤、棕壤和鹽漬土中，結果發現，生物炭對紅壤細菌群落的改變最為顯著[11]。武愛蓮等發現，隨著生物炭施用量的增加，土壤細菌的操作分類單元（OTU）數目及豐富度指數（Chao1）呈增加趨勢[12]。顧美英等發現，不同的生物炭用量對不同土壤微生物的影響不同[13]。生物炭對土壤微生物量、微生物群落結構的影響差異較大，這種差異可能與生物炭用量、類型以及土壤類型等有關。

多數研究結果表明，生物炭對紅壤有改良效果[14-15]，但缺少關于生物炭對紅壤和潮土作用的對比研究。紅壤和潮土為我國2類分布廣泛、性質相反的土壤，對比分析生物炭對2類土壤微生物群落的作用，對于闡明生物炭對土壤微生物群落結構的影響，指導生物炭在農田中的應用具有重要的意義。因此，本試驗采用在500 ℃厭氧條件下制備的花生殼生物炭，設置生物炭和菜地土壤質量比分別為0.5%、1%、2%、4%，通過培養試驗和PLFA法，以2種土壤的PLFAs含量表征土壤微生物群落結構，分析不同施炭量對紅壤和潮土微生物群落結構特征的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

潮土采集地點為天津市武清區梅廠鎮周莊村（39°36′N，117°13′E），紅壤采集地點為湖南省長沙市長沙縣金井鎮脫甲村（28°25′N，113°21′E）。供試花生殼生物炭由河南三利新能源有限公司提供，為在500 ℃厭氧條件下熱解制備的生物炭。供試土壤的基本理化性質如表1所示。供試生物炭基本理化性質如下：pH值為9.71，比表面積為5.38 m2/g，孔容為0.01 cm3/g，孔徑為5.81 mm，灰分含量為333%，碳、氫、氮、氧含量分別為719.26、20.51、17.63、90.22 g/kg。施用生物炭對土壤理化性質的影響見參考文獻[16]。

1.2 生物炭表面特征

通過對生物炭進行電鏡掃描和能譜分析可以看出，生物炭中含有大量的孔隙結構（圖1），這是生物炭表現出各種功能的重要結構原因。由傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）圖譜可以得出，波數為 3 700 cm-1 左右的吸收峰由羥基（—OH）引起， 3 400 cm-1 左右的吸收峰由—CH2和—CH3的伸縮振動引起，2 300 cm-1、1 600 cm-1和 1 000 cm-1 左右的吸收峰分別是由烯烴（炔烴）、芳香環和醇類基團引起的，說明生物炭中含有該類功能基團。

1.3 試驗設計

采用土柱培養試驗，每種土壤各設計6個處理，其中包括空白對照處理（CK），單獨添加氮肥處理（N），生物炭與土壤的質量比為0.5%（B1）、1%（B2）、2%（B3）、4%（B4）處理，則紅壤（R）各處理依次表示為RCK、RN、RB1N、RB2N，RB3N、RB4N;潮土（M）各處理依次表示為MCK、MN、MB1N、MB2N、MB3N、MB4N，每個處理設3次重復。土柱裝置為直徑 21 cm，高度45 cm的不銹鋼圓柱管。試驗于2017年3月開始進行，將不同比例生物炭均勻施入到過5 mm篩的土壤中，將土壤與生物炭按質量比充分混勻后慢慢壓實裝入土柱裝置中[14]。每個土柱內裝填的生物炭和土壤總質量均為12 kg，不添加生物炭與添加4%生物炭處理高度相差不超過2 cm。培養期間種植小白菜，每個處理種植5顆小白菜，同年6月底收獲。土壤培養和小白菜種植方法參考文獻[16]。

1.4 樣品采集

試驗結束后，采集土柱中0～20 cm耕層土壤，土樣采集后分成 2 份，一份于-20 ℃ 冰箱鮮樣保

存，用于測定土壤硝態氮、銨態氮含量和微生物指標;另一份先風干，然后研磨過篩（20目和100目），用于土壤pH值、有機碳含量、全氮含量等土壤理化性狀的測定。

1.5 測定指標與方法

采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定土壤中有機質含量;利用環刀法測定土壤容重;土壤pH值用MP511型pH計進行測定;采用凱氏定氮法測定土壤全氮含量;利用AA3型流動分析儀（德國Bran+Luebbe公司）測定土壤硝態氮、銨態氮含量。生物炭的理化性質采用元素分析儀（德國Elementar公司）測定。

土壤微生物群落結構采用PLFA法測定，具體如下：

（1）脂肪酸的提取。采用修正的Wu等方法[17]提取脂肪酸。（2）磷脂脂肪酸的分離。用固相萃?。⊿PE）柱，利用氯仿和丙酮將中性脂和糖脂淋洗出來，然后加入甲醇，淋洗出磷脂脂肪酸，最后用氮氣吹干。（3）磷脂脂肪酸甲酯化。先將磷脂脂肪酸進行甲酯化，然后萃取磷脂脂肪酸甲酯，加入內標（C19：0脂肪酸，0.1 mg/mL）后用氮氣吹干得到脂肪酸甲酯。（4）磷脂脂肪酸的測定和命名。將脂肪酸甲酯重新溶解于0.5 mL正己烷中，利用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MC）檢測，參數如下：初始溫度為120 ℃（7 min）;進樣口溫度為250 ℃;載氣為He2（0.9 mL/min）;離子源溫度為230 ℃;四級桿，150 ℃;質譜全掃描范圍為30～500 m/z，每次進樣量為2 μL。本試驗由7890-5975 C型安捷倫 GC-MS 檢測完成。

磷酯脂肪酸的定量分極采用峰面積和內標曲線法。PLFA含量單位為nmol/g。

采用參考文獻[18]中的方法對磷脂脂肪酸命名（表2）。

1.5 數據統計

以PLFA生物標記物為研究對象，采用香農-威納（Shannon-Weiner）多樣性指數（H）和辛普森（Simpson）優勢度指數（D）、Pielou均勻度指數（E）表征群落多樣性。計算方法如下：

式中：Pi=Ni/N，Ni是i處理中的磷脂脂肪酸數量，N是該試驗中的總磷脂脂肪酸數量。

（3）Pielou均勻度指數：

式中：H是實際觀測到的Shannon-Weiner多樣性指數;Hmax是最大的物種多樣性指數。Hmax=lnS，S

冗余分析采用Canoco for Windows 4.5軟件;利用Excel 2007對數據進行處理以及圖表的繪制，SPSS 17.0軟件對試驗數據進行單因子方差分析，Duncans多重比較對處理進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 生物炭對土壤微生物群落結構的影響

由圖2可知，在添加生物炭的處理中，潮土中的細菌PLFAs含量隨著生物炭添加量的增加明顯升高，其他添加生物炭處理與B1N相比升高了9.5%～567%;與單施氮肥相比，添加0.5%和1.0%生物炭處理的細菌PLFAs含量分別顯著降低了33.7%、273%。添加0.5%、2.0%、4.0%生物炭處理的潮土中革蘭氏陰性細菌PLFAs含量與單施氮肥處理相比顯著下降了276%～48.8%?？傮w來看，生物炭施用對潮土真菌、放線菌、革蘭氏陽性細菌和總PLFAs含量的影響總體不顯著。生物炭施用沒有對紅壤的微生物PLFAs含量產生顯著的影響。

2.2 生物炭施用對2種土壤微生物PLFAs比值的影響

如圖3-a所示，與單施氮肥相比，添加0.5%、10%、2.0%生物炭處理的潮土中環丙烷脂肪酸含量/前體脂肪酸含量分別顯著降低了52.8%、382%、50.7%，添加1.0%生物炭處理的紅壤中環丙烷脂肪酸含量/前體脂肪酸含量顯著增加412%。與未添加生物炭相比，生物炭添加總體上未對紅壤和潮土中飽和脂肪酸含量/不飽和脂肪酸含量產生明顯影響。但由圖3-b可以看出，在添加生物炭的處理中，隨著生物炭添加量的增加，飽和脂肪酸含量/不飽和脂肪酸含量有下降趨勢。

真菌PLFAs和細菌PLFAs含量的比值（真/細）可以反映土壤微生物生態系統的相對穩定性，而革蘭氏陽性細菌和陰性細菌的比例可以反映土壤的貧瘠程度，更高比例的革蘭氏陰性細菌意味著土壤趨向于富養型土壤轉變。圖3-c、3-d反映了生物炭添加對真/細和革蘭氏陽性細菌PLFAs含量/革蘭氏陰性細菌PLFAs含量的影響，與對照相比，添加生物炭對真/細沒有明顯影響，但與單施氮肥相比，潮土和紅壤中G+/G-發生了明顯變化，潮土G+/G-明顯增加了13.7%～109.8%，其中添加05%生物炭處理（MB1N）的G+/G-最高。對于紅壤中G+/G-，與單施氮肥處理相比，添加2.0%（RB3N）和4.0%生物炭處理（RB4N）分別明顯降低了48.2%和34.8%。

通過分析微生物群落多樣性的3個指數（香農-威納多樣性指數、辛普森優勢度指數、Pielou均勻度指數）可知，大體上看，與未添加生物炭相比，生物炭施用對2種土壤微生物群落結構的多樣性無明顯影響（表4）。

2.3 2種土壤PLFAs主成分分析

圖4表明，成分1和成分2分別解釋了880%和5.8%的變異，生物炭施入沒有使2類土壤PLFAs的組成產生明顯的區別。

對土壤理化性質和土壤PLFAs含量進行冗余分析可知，成分1和成分2分別解釋了 38.6%和22%的變異;其中，pH值對土壤微生物群落的影響較大，這與偏相關分析得出的結論一致，并且成分1

明顯區分了潮土和紅壤的微生物PLFAs含量，說明生物炭施用明顯影響了潮土和紅壤的微生物群落結構（圖5）。

3 討論

已有研究表明，施用生物炭能夠引起土壤微生物群落結構變化，增加微生物量，促進微生物生長及活動[19]。在亞馬遜黑色土壤及生物炭改良的土壤中，發現了土壤真菌、細菌和古菌群落組成和多樣性發生了顯著變化[20-21]。袁晶晶等研究表明，施用生物炭后，土壤細菌、真菌放線菌含量分別提高10.9%、6.6%、50.6%[22]。Jones等的研究也有類似的結果[3，23]。Anderson等通過短期和長期試驗發現，生物炭對土壤的細菌群落結構無顯著影響[24-25]。He等發現，在熱解溫度為500 ℃的條件下制德的稻殼生物炭不會對堿性土壤產生顯著影響[26]。蓋霞普等研究表明，生物炭未對中性水稻土的微生物群落結構產生影響[27]。這也表明了生物炭的施用效果會隨土壤類型的不同而產生差異。本試驗中發現，在添加生物炭的處理中，隨生物炭施用量的增加，潮土中細菌的含量略有升高，但紅壤未表現出明顯的差異。生物炭本身攜帶養分并具有較大的孔隙度，這是影響土壤微生物群落結構的重要原因。生物炭施入土壤中能夠改變土壤的養分含量、提高土壤pH值、吸附土壤中的有毒物質、為微生物提供了良好的棲息場所等[28-30]。Anderson等認為，作物對土壤系統的擾動比生物炭的影響更大，根系-土壤系統間的相互作用是短期生物炭刺激要考慮的重要因素[31]，這也可能是本試驗與前述研究結果不一致的原因。本試驗的生物

炭施用時間較短，有研究者認為，長期添加生物炭和短期施用生物炭的土壤中微生物群落存在明顯差異[9]。

生物炭改善土壤肥力和土壤生態環境機制多被解釋為通過提高土壤pH值和吸附作用，改善土壤養分利用情況，同時改變土壤微生物群落組成及豐度[32]，進而對土壤養分循環或理化性質產生作用，最終影響作物生長[33]。同時，程揚等通過高通量測序技術的研究結果表明，生物炭施加對土壤微生物群落代謝、遺傳、信息傳遞等過程產生影響，從而改變微生物的群落結構及生態功能[34]。Wang等研究表明，潮土中添加生物炭后，土壤微生物群落的改變與土壤有機碳（SOC）、全氮（TN）含量的變化密切相關[35]。李明等的典范對應分析結果表明，水稻和玉米秸稈生物炭添加可以通過改變紅壤水稻土壤性質，間接影響微生物群落結構，其中，土壤速效磷、有機碳、速效鉀含量與土壤微生物群落分布顯著相關[36]。Muhammad等對紅壤的研究結果則表明，豬糞炭和果皮炭等主要通過增加土壤pH值、可溶性有機碳（DOC）含量和碳氮養分元素含量，改變微生物群落結構[37]。Yao等研究表明，向黑土添加生物炭后，土壤真菌和細菌群落的變化均與土壤pH值以及全碳、全氮、全鉀含量緊密相關[38]。土壤容重的變化與土壤透氣性、持水力和營養鹽遷移等密切相關，絕大部分的土壤微生物屬于好氧型，多屬于腐生性微生物，疏松土壤環境為微生物提供了充足的氧氣，生物炭的多孔性和表面特性為土壤微

生物生長與繁殖提供了良好的棲息環境[39]，共同影響著土壤微生物群落的分布。

本試驗通過3個方面來研究生物炭對土壤微生物群落結構的影響，一是土壤不同微生物的PLFAs比例，二是土壤微生物群落的多樣性，三是土壤微生物的群落組成與主成分分析。

革蘭氏陽性細菌可利用生物炭中的芳香族化合物，革蘭氏陰性菌在生物炭中缺少容易利用的底物[40]，但添加生物炭均能增加二者的豐度，如添加生物炭到溫帶農田土壤中可使革蘭氏陽性細菌比例升高[41]，在風積土、潮土和栗鈣土中施用生物炭革蘭氏陰性細菌比例均增加。細/真對土壤理化性質的改變極為敏感，通常用來表征在有環境脅迫的條件下，微生物群落結構的變化。一般認為，以真菌為主的微生物類群，能夠增加土壤碳的穩定性。土壤真菌和細菌對生物炭輸入的響應不同，Khadema等研究表明，在鈣質沙土和黏土中施用生物炭能夠降低真/細[42]。本試驗發現，施用生物炭后，土壤真/細未發生明顯變化。有研究認為，真菌對土壤pH值的適應范圍比細菌寬，真菌數與土壤pH值相關性較小，主要受土壤有機碳含量的影響[43]。陳坤等研究表明，生物炭添加引起土壤pH值升高，細菌豐度增加，而真菌豐度變化并不明顯[44]，本試驗的結論與之一致。飽和脂肪酸含量/不飽和脂肪酸含量常被用來指示土壤的透氣性，飽和脂肪酸含量越高，代表著透氣性越差，本試驗中，在添加生物炭的處理中，隨著生物炭施用量的增加，土壤的飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸含量有下降的趨勢，這也說明生物炭施用對于土壤透氣性有改善的作用。

生物炭被認為是能夠有效減少農田廢棄物、改良土壤性質的材料，其在土壤生態、土壤修復、炭基肥料等中的應用得到了越來越多的重視[45-46]。目前關于生物炭對土壤微生物的研究多集中于微生物性質、微生物群落的分化上，為未來研究微生物群落的功能性奠定了基礎，關于土壤酶與功能微生物的互作效應、土壤動物和生物炭材料等方面[47]，有待進一步探討。

4 結論

潮土中細菌PLFAs含量在添加生物炭的處理中隨著生物炭添加量的增加而明顯升高，其中B2N、B3N、B4N處理的PLFAs含量與B1N相比升高了95%～56.7%，與單施氮肥相比，添加0.5%和10%的生物炭處理的細菌的含量分別顯著降低33.7%、27.3%;B1N、B3N、B4N處理的革蘭氏陰性細菌含量與單施氮肥處理相比顯著下降27.6%～48.8%，生物炭施用對真菌、放線菌、革蘭氏陽性細菌、真/細和總PLFAs含量總體無顯著影響。生物炭施用對紅壤中微生物PLFAs含量無顯著影響。

通過分析土壤不同微生物的PLFAs比例、土壤總PLFAs含量，研究土壤微生物群落多樣性和土壤微生物的群落組成，采用主成分分析來研究2種土壤微生物群落結構的差異。結果表明，短期生物炭刺激土壤微生物的群落結構的改變不顯著，生態位未發生明顯分離。

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