鮮牛奶中丙酸桿菌的篩選、鑒定及特性分析

范小飄,高文文,李欣芮,趙 桉,趙鵬昊,尚佳萃,趙 樂,周 雪,孟祥晨

(東北農業大學食品學院,乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱150038)

丙酸桿菌是無芽孢、革蘭氏陽性的兼性厭氧菌,主要存在于干酪、生牛奶及其他乳制品、青貯飼料、土壤中,最近有人在酒曲和窖泥中也分離到了丙酸桿菌[1]。丙酸桿菌作為益生菌的應用極其廣泛,如食品發酵劑、抑制病原微生物、維持腸道菌群平衡、促進其他益生菌增殖、抗炎、提高機體免疫力等益生功能[2-4],因此,研究人員常將丙酸桿菌作為微生態制劑添加到食品、藥品、飼料等多種領域以發揮多種益生作用。傳統上,丙酸桿菌被用作瑞士干酪的發酵劑,特別是費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii),在瑞士干酪成熟過程中,賦予干酪典型的大孔質地和特征性的風味[2],費式丙酸桿菌謝氏亞種(P.freudenreichiisubsp.shermanii)JS最初分離自瑞士干酪,幾十年來一直作為芬蘭Jarlsberg干酪的發酵劑使用,該菌株還與鼠李糖乳桿菌 LC705聯合用作保護性發酵劑,用于發酵食品的生物防腐[5]。除此之外,丙酸桿菌能通過促雙歧桿菌生長來調節腸道微生物菌群,并通過產生細菌素來保護機體免受病原微生物的侵染[6]。其與嗜酸乳桿菌、動物雙歧桿菌亞種組合,可用于生產益生菌飲料,感官評價表明上述微生物組合發酵可以生產風味更好的飲料[7]。最新研究表明丙酸桿菌可粘附于腸上皮細胞具有調節腸粘膜的重要功能,并且其表面蛋白參與抗炎特性[4]。因此,丙酸桿菌是極具潛力，并對人們有利的益生菌。

丙酸桿菌的主要代謝產物為丙酸,又被稱作甲基乙酸,是一種重要的天然有機弱酸。美國食品藥品監督管理局認為丙酸及其鈣、鈉和鉀鹽是一般公認安全(Generally recognized as safe,GRAS)的食品添加劑,廣泛應用于抗微生物劑[8]、抗炎劑[9]、食品防腐劑[10]、除草劑[11]和人造香料[12]等。近年來,由于人們對天然食品和綠色添加劑需求的日益增加,通過微生物發酵生產丙酸獲得更多關注。Wang等[13]篩選到的一株費氏丙酸桿菌,以葡萄糖為碳源時,丙酸生成量為0.39 g/g,葉文彬等[14]獲得的一株丙酸桿菌,丙酸初始生成量為1.2 g/L。由此可見,獲得高產丙酸的菌株對生產非常重要。因此,本實驗旨在分離篩選獲得高產丙酸的菌株,并分析其基本生物學性質,以期為后續高產丙酸菌株的育種以及生物防腐菌種的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮生牛乳 黑龍江省哈爾濱市農戶家奶牛;金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923 中國藥品生物制品檢定所;丙酸(色譜純) 西亞試劑;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;細菌微量生化反應管 青島海博;藥敏紙片 上海源葉生物科技有限公司；引物合成 吉林庫美生物科技有限公司;其余試劑 均為分析純。

Opticlean-1300垂直流潔凈工作臺 力康精密科技(上海)有限公司;3K15離心機 美國Sigma公司;光學顯微鏡 上海光學儀器廠;Uvmini-1240紫外分光光度計 日本島津公司;HPX-87H色譜柱 美國Bio-Rad公司;Waters2695高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 分離純化培養基參考文獻[15]。

葡萄糖培養基:葡萄糖10 g,胰蛋白胨10 g,酵母浸粉10 g,加蒸餾水至1000 mL。固體培養基則添加1.8%～2.0%的瓊脂。調pH至6.9～7.0,121 ℃滅菌15 min。

甘油培養基:甘油10 g,胰蛋白胨10 g,酵母浸粉10 g,加蒸餾水至1000 mL。調pH至6.9～7.0,121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 產丙酸菌的初篩 參照李燕波等[15]的方法,將新鮮生牛乳用磷酸鹽緩沖液(PBS)梯度稀釋并涂布于固體培養基上初步篩選產丙酸的菌株。

1.2.3 菌株的復篩 以總細菌數為1×108CFU/mL的接種量將初篩中獲得的菌株接種于葡萄糖液體培養基中,30 ℃厭氧培養120 h,取1.5 mL發酵液于EP管中,12000 r/min離心10 min,小心吸取上層發酵液,經0.22 μm濾膜過濾后,采用高效液相色譜分析方法測定發酵液中丙酸含量。

1.2.4 高效液相色譜 高效液相色譜條件參照Liu等[16]的方法稍作修改:色譜柱:Biorad Aminex HPX-87H 300 mm×7.8 mm;檢測器:紫外檢測器(210 nm);流動相:5 mmol/L稀硫酸溶液;流動相流速:0.5 mL/min;柱溫:50 ℃;進樣量:10 μL。測定丙酸標準品的保留時間為20.5 min,質量濃度(g/L)與峰面積的回歸方程為:y=559847x+29157(式中,x代表質量濃度g/L,y代表峰面積),其決定系數R2=0.9998。

1.2.5 分離株菌種鑒定

1.2.5.1 形態學特征 將篩選得到的產丙酸含量最高的菌株B1以總細菌數為1×108CFU/mL的接種量接種于葡萄糖液體培養基中,于30 ℃厭氧培養60 h,連續活化兩代后,梯度稀釋涂布于固體培養基中,30 ℃厭氧培養5 d后觀察其菌落形態,并在超凈工作臺中挑取單菌落進行革蘭氏染色后,置于光學顯微鏡下進行觀察。

1.2.5.2 生理生化及糖發酵實驗 參照《伯杰細菌鑒定手冊》,對分離株進行硝酸鹽還原試驗、過氧化氫酶試驗、明膠水解試驗、產氣、運動性試驗以及糖發酵試驗。

1.2.5.3 16S rDNA同源性分析 細菌基因組DNA的提取:按照天根細菌基因組DNA提取試劑盒說明書稍作修改進行基因組DNA的提取;16S rDNA基因片段擴增反應的上下游引物、PCR擴增反應總體系以及擴增條件參照張秋雪等[17]的方法。

PCR擴增完成后,進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,若擴增產物長度在1500 bp左右且無雜帶,則將其送至測序公司進行雙向測序。將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對后,使用MEGA 7軟件并采用Neighbor-Joining方法將Bootstrap設置為1000,對分離株構建系統發育樹。

1.2.5.4 多位點序列分型(MLST) 本試驗選取了在丙酸桿菌菌株鑒定中常用的7個管家基因[18]:pf169、fumC、pf1637、recA、gtf、rpoB、adk,其上下游引物信息見表1。

表1 丙酸桿菌MLST擴增引物Table 1 The MLST primers for Propionibacterium

管家基因的PCR擴增體系與16S rDNA基因的擴增體系相同。其擴增反應條件如下:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,58/59/60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環40次;最后72 ℃末端延伸10 min。其中管家基因pf169退火溫度為59 ℃,管家基因gtf退火溫度為60 ℃,其余管家基因退火溫度都為58 ℃。將7個管家基因的測序結果順序拼接并進行Blast對比,構建系統發育樹,進一步分析分離株間的親緣關系。

1.2.6 分離株B1在不同培養基中生長及丙酸生成量的測定

1.2.6.1 生長曲線 以總細菌數為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株分別接種于葡萄糖液體培養基以及甘油液體培養基中,30 ℃厭氧培養120 h,每間隔12 h取1次發酵液,紫外分光光度計測其OD600、pH計測其pH,然后以時間為橫坐標,OD600、pH分別為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.6.2 丙酸生成量的測定 以總細菌數為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株分別接種于葡萄糖液體培養基以及甘油液體培養基中,30 ℃厭氧培養120 h,每間隔12 h各取發酵液1.5 mL,將發酵液離心處理(12000 r/min 10 min),仔細吸取發酵上清液,經過0.22 μm濾膜過濾后置于棕色進樣瓶中,采用高效液相色譜(HLPC)方法測定丙酸含量。

1.2.6.3 葡萄糖殘留量的測定 以總細菌數為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株接種于葡萄糖液體培養基中,30 ℃厭氧培養120 h,每間隔12 h取發酵液,參照彥繁鶴等[19]的試驗方法測葡萄糖殘留量。測定葡萄糖標準曲線為y=0.8941x-0.0179(式中,x代表質量濃度g/L,y代表吸光度值),其決定系數R2=0.9991。

1.2.6.4 甘油殘留量的測定 以總細菌數為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株接種于甘油液體培養基中,30 ℃厭氧培養120 h,每間隔12 h取發酵液,參照張永生等[20]的試驗方法測定甘油殘留量。測定甘油標準品的標準曲線為y=0.0266x+0.0222(式中,x代表質量濃度g/L,y代表吸光度值),其決定系數R2=0.9997。

1.2.7 分離株B1體外安全性評價

1.2.7.1 溶血性實驗 通過血平板培養法檢測Propionibacteriumfreudenreichiisubsp.shermanii是否具有溶血性。將連續活化兩代的分離株劃線于含質量濃度為5%人血的哥倫比亞血瓊脂培養基,放置厭氧罐中于30 ℃連續培養6 d,觀察菌落周圍是否有透明的溶血圈出現(β溶血)或綠色暈圈出現(α溶血)或無反應(γ溶血),以此判斷受試菌株是否具有溶血性,同時以金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC23957)作為陽性對照菌株。

1.2.7.2 抗生素抗性實驗 本試驗采用藥敏紙片擴散法。將待測菌株以總細菌數為1×108CFU/mL的接種量接種于葡萄糖液體培養基中,30 ℃厭氧培養48 h后,在超凈工作臺中吸取0.1 mL菌懸液均勻涂布于固體培養基上,待培養基表面干燥后,分別鑷取含有不同抗生素的藥敏紙片貼于培養基表面(每個平板貼3張同一藥敏試紙并保持一定間距),30 ℃厭氧培養48 h后,用游標卡尺測量抑菌圈直徑。依據美國臨床和實驗室標準協會(NCCLS)的藥敏試驗標準執行。不同抗生素的濃度及判定標準見表2。

表2 藥敏判定標準Table 2 Criterion of drug susceptibility

1.3 數據處理

以上所有試驗均進行3次重復。運用Origin 2018對試驗所得數據繪圖,運用SPSS 23進行差異性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

采用高效液相色譜方法檢測了54株分離菌株培養上清中的丙酸含量,部分結果見表3,大多數菌株的丙酸含量在1.8～3.2 g/L,只有一株菌(B1)的含量達到7.38 g/L,顯著高于其他分離株(P<0.05),使用該菌株作為后續試驗菌株。

圖2 基于16S rDNA基因構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene

表3 部分分離株培養上清中丙酸含量Table 3 Content of propionic acid in theculture supernatant of some isolates

2.2 分離株B1的鑒定

2.2.1 形態學特征 分離株在固體培養基中30 ℃厭氧培養6 d后,形成直徑1 mm左右、乳黃色菌落,微突起,不透明,邊緣整齊,表面濕潤光滑(圖1A)。菌體革蘭氏染色陽性,多為短桿狀,單在或成對存在,呈“v”字和“y”字形(圖1B)。

圖1 分離株B1菌落(A)及菌體(B)形態Fig.1 Colony(A)and cell morphology(B)of isolated strain B1

2.2.2 生理生化及糖發酵試驗 經過生理生化及糖發酵試驗,結果比對《伯杰氏細菌鑒定手冊》,初步鑒定分離株為費氏丙酸桿菌(表4)。費氏丙酸桿菌有兩個亞種:費氏丙酸桿菌謝氏亞種(P.freudenreichiisubsp.shermanii)和費氏丙酸桿freudenreichiisubsp.freudenreichii),前者可以利用乳糖但不還原硝酸鹽,而后者不能利用乳糖但可以還原硝酸鹽[18],利用這一特性可以區分兩個亞種,據此分析,本實驗獲得的為P.freudenreichiisubsp.shermanii。

表4 分離株的生理生化和糖發酵試驗結果Table 4 Physiological biochemical and sugar fermentation identification results of isolated strains

2.2.3 16S rDNA序列同源性分析 以分離株B1的DNA為模板,采用通用引物進行PCR擴增,PCR擴增產物片段達1500 bp后送至測序公司進行測序,將測序結果進行同源性分析并構建系統發育樹,結果顯示分離株B1與費氏丙酸桿菌親緣關系最近,同源性為100%(圖2)。

2.2.4 多位點序列分型(MLST) 以分離株B1的DNA為模板,對7個管家基因(pf169、fumC、pf1637、recA、gtf、rpoB、adk)進行PCR擴增,獲得7個300～600 bp左右長度的擴增產物(圖3)。將7個管家基因序列依次串聯起來,得到的片段長度大約為3000 bp,經Blast比對后構建系統發育樹(圖4),結果顯示:分離株B1與Propionibacteriumfreudenreichiisubsp.shermaniiPFREUDJS1的同源性達到100%,結果進一步表明:分離株B1為費氏丙酸桿菌謝氏亞種。

圖4 基于七個等位基因構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on seven alleles

圖3 等位基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.3 Agarose gel electrophoresis resultsof allele amplification prod注:M:D2000;1～7:管家基因1～7。

2.3 分離株B1的生長及丙酸生成量

2.3.1 B1在含葡萄糖培養基中生長及產酸情況 菌株B1在0～36 h為對數生長期,36 h后趨于穩定期,到達穩定期后,菌體量基本不變,其OD最終穩定在2.4左右,當培養時間在84 h左右時,pH最終穩定在4.1左右(圖5A),而丙酸生成量此時達到7.0 g/L左右(圖5B)。培養120 h后，丙酸生成量達到7.38 g/L(圖5B)。

圖5 費氏丙酸桿菌B1在含葡萄糖培養基中的生長(A)和產丙酸(B)情況Fig.5 Growth(A)and propionic acid production(B)ofPropionibacterium freudenreichii B1 in glucose-containing medium

分析生長期間葡萄糖的消耗發現,0～72 h葡萄糖消耗速度較快,在第72 h時,葡萄糖消耗了88%,其后的72～120 h葡萄糖消耗放緩,在發酵120 h結束時,消耗了98.5%的葡萄糖(圖6)。

圖6 丙酸桿菌B1葡萄糖殘留量Fig.6 Glucose residue of Propionibacterium B1

2.3.2 B1在含甘油培養基中生長及產酸情況 菌株B1在0～36 h為對數生長期,36 h后穩定一段時間,在60 h后又有短暫的生長,72 h后到達穩定期后,菌體量基本不變,其OD最終穩定在1.5左右,最終pH在4.75左右(圖7A),丙酸生成量最終達到5.45 g/L左右(圖7B)。

圖7 費氏丙酸桿菌B1在含甘油培養基中的生長(A)和產丙酸(B)情況Fig.7 Growth(A)and propionic acid production(B)ofPropionibacterium freudenreichii B1 in glycero-containing medium

分析生長期間甘油的消耗得出(圖8),在0～36 h內,甘油被迅速消耗。其后甘油消耗緩慢,在發酵120 h后,甘油殘留量仍在5.9 g/L,僅消耗41%的甘油。說明分離株B1在同等時間及培養條件下利用甘油生長及生成丙酸的能力較弱。

圖8 丙酸桿菌B1甘油殘留量Fig.8 Glycerin residue of Propionibacterium freudenreichii B1

2.4 分離株B1安全性的體外評價

2.4.1 溶血性 陽性對照菌S.aureusATCC25923在血瓊脂平板上菌落較大,凸起,淡黃色不透明,菌落周圍出現明顯的透明溶血圈(圖9B);而費氏丙酸桿菌B1在血瓊脂平板上無反應現象,菌落較小,表明該菌株不具有溶血性(圖9A)。

圖9 丙酸桿菌B1(A)和S. aureus ATCC25923(B)在血瓊脂平板上的生長Fig.9 Hemolytic test of Propionibacterium B1(A)and S. aureus ATCC25923(B)

2.4.2 抗生素敏感性 本試驗檢測了費氏丙酸桿菌B1對10種抗生素的敏感性,并將S.aureusATCC25923作為質控菌株。結果表明:該菌對氨芐西林、四環素、萬古霉素、氯霉素、克林霉素敏感,對卡那霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素具有抗性,此外對頭孢呋辛、青霉素也具有抗性(表4),需要進一步評價其抗生素抗性機制及抗性轉移風險。

表5 丙酸桿菌B1對抗生素的敏感性Table 5 Sensitivity of Propionibacterium B1 to antibiotics

3 討論

從新鮮生牛奶中通過選擇性培養基,分離得到一株產丙酸的費氏丙酸桿菌B1,除分析了其形態特征、生理生化和糖發酵特性之外,還采用MLST方法分析了這株菌的系統發育特點?；贛LST方法構建的系統發育樹與16S rRNA基因構建的系統發育樹相比,可以更精確地反映出物種及物種間的進化關系[21]。Delmasso等[18]將113種不同起源的費氏丙酸桿菌亞種通過MLST分型分為46種序列類型(ST),說明費氏丙酸桿菌的分子多樣性和種群結構。Mekadim等[21]針對11株丙酸桿菌,比較了16S rRNA同源性分析和選取3個管家基因進行的MLST分析,分別構建系統發育樹,發現三種基因的可變區具有更高的分辨力。本實驗選取了7個管家基因,分辨效果更好。

碳源種類顯著影響丙酸桿菌的丙酸生成量,Wang等[13]篩選到的一株費氏丙酸桿菌,以葡萄糖為碳源時,丙酸生成量為0.39 g/g,葉文彬[14]獲得的一株酸性丙酸桿菌,在以葡萄糖為碳源時,丙酸初始生成量為1.2 g/L。本試驗獲得的費氏丙酸桿菌,同樣以葡萄糖為碳源時,丙酸產量最高達到7.59 mg/mL,顯著高于現有文獻報道。丙酸桿菌代謝產物中主要抑菌物質即為丙酸,鄭麗雪等[22]研究發現費氏丙酸桿菌在乳酸鈉培養基發酵時,該菌株代謝產物的抑菌活性結果要優于山梨酸鉀的抑菌活性。因而篩選一株高產丙酸的菌株十分重要。

理論上,培養基中葡萄糖和甘油在重量相同時,甘油發酵可生成更多的丙酸,通常,1 mol甘油通過EMP途徑產生1 mol丙酸而不產生乙酸,理論上丙酸產量為0.80 g/g;而1 mol葡萄糖通過EMP途徑產生4/3 mol丙酸和2/3 mol乙酸,理論上丙酸產量為0.55 g/g[13]。但由于甘油發酵會出現氧化還原失衡,導致細胞生長減少和丙酸生成量下降[23],因此,分離株B1在葡萄糖培養基中生長狀況較好,并且產生更多的丙酸。

菌株抗生素抗性具有轉移風險,因此對于具有應用潛力的菌株需要評價其抗生素抗性。Suomalainen等[24]評價了P.freudenreichiissp.shermaniiJS和P.freudenreichiisubsp.freudenreichii131的抗生素抗性,結果顯示菌株對氨芐青霉素、紅霉素、維吉霉素、四環素、氯霉素、萬古霉素、甲基鹽霉素、桿菌肽敏感;對鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素具有抗性。Monika等[25]也發現菌株P.jensenii對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素具有抗性,對其他類抗生素都敏感。Derya等[26]發現29種丙酸桿菌菌株都對萘啶酸(naldixic acid)有抗性,對慶大霉素、卡那霉素、利福平、多粘菌素耐藥性低,對其它抗生素敏感。上述研究結果表明:丙酸桿菌對卡那霉素等氨基糖苷類抗生素的抗性是厭氧細菌的共同特征,因為它們缺乏細胞色素介導的藥物轉運系統[27]。本研究的費氏丙酸桿菌B1也具有這一特點,但同時也發現該菌對頭孢呋辛及青霉素也具有抗性,需要進一步分析耐藥機制以及耐藥性轉移的風險。

4 結論

從生牛奶中分離得到一株費氏丙酸桿菌,生長周期大約為120 h,0～36 h為對數生長期,36 h后趨于穩定期。發現其對葡萄糖的利用率大于對甘油的利用率,在含葡萄糖的培養基中于30 ℃厭氧培養120 h后丙酸產量達到7.38 g/L。該菌株無溶血性,對卡那霉素等氨基糖苷類抗生素有耐藥性,對青霉素和頭孢呋辛也具有抗性,而對氨芐西林、萬古霉素、氯霉素、克林霉素、四環素敏感。需進一步評價其耐藥基因的轉移風險。以上初步研究結果表明丙酸桿菌B1具有潛在的應用價值,但在使用之前應更全面地評估該菌株的安全性和益生功能。