水翁花蕾提取物DMC對胰脂肪酶的抑制作用研究

李 婷,向燦輝,王文君

(遵義醫科大學珠海校區,生物工程系,廣東珠海 519041)

肥胖和超重是指體內脂肪異?；蜻^多的堆積[1],據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)統計顯示[2],自1975年來,肥胖人數已增長近三倍,超過6.5億人肥胖,成年人中有39%超重,其中13%肥胖。肥胖不僅會影響生活質量[3],還是許多疾病的主要危險因素[4],包括糖尿病[5]、心血管疾病[6-7]和癌癥[8-9],如何有效預防和治療肥胖是當今研究的熱點。胰脂肪酶(Pancreatic Lipase,PL)[10]是消化食物脂肪的主要消化酶,可以將膳食中的脂肪水解為單酰甘油和脂肪酸,單酰甘油和脂肪酸再被機體吸收合成脂肪,造成脂肪堆積,抑制PL活性可減少機體對膳食中脂肪的水解和吸收,從而預防或治療肥胖。奧利司他是唯一臨床批準上市的胰脂肪酶抑制劑藥物,來源于微生物,除具有令人不愉快的胃腸道反應(油性糞便、油性斑點及胃脹氣等[11])外,FDA在2015年的報告中指出長期服用奧利司他會增加肝損傷、胰腺炎、膽結石和腎結石的風險[12],因此,尋找更安全有效的抗肥胖藥物具有十分重要的意義。

植物來源的天然化合物是高效低毒藥物的一個重要來源,研究顯示植物中的黃酮類化合物可抑制PL活性[13]。Jo等[14]從拓木中分離出14種黃酮類化合物,有6種黃酮類化合物對PL抑制率大于50%;Zeng等[15]研究顯示陳皮提取物對PL有抑制作用,采集時間不同,黃酮類化合物含量也有所區別,且陳皮提取物對PL的抑制作用與總黃酮含量呈正相關關系。水翁花是“清熱涼茶”中成藥主要成分之一,主要來源于廣東、廣西等省,民間常將其熬煮做涼茶。2′,4′-二羥基-6′-甲氧基-3′,5′-二甲基查耳酮(2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone,DMC)是中藥材水翁花蕾中黃酮類的主要成分之一[16],Zhang等[17]研究發現水翁花不同極性提取部位及提取物DMC對PL有抑制作用,但未深入研究其抑制機理。因此,本文進一步研究DMC對PL的抑制作用,并探索DMC與PL的相互作用及作用機理,為開發DMC作為PL抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DMC 本課題組從水翁花蕾中分離得到[18],經超高效液相色譜儀檢測純度為98.56%;奧利司他和4-硝基苯丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate,pNPB) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;胰脂肪酶(來自豬胰,30000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP) 上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜 天津市大茂化學試劑廠;其他化學試劑 均為國產分析純。

F-4600熒光分光光度計 日本日立公司;Cary 8454 UV-Vis 安捷倫科技有限公司;JB-3恒溫定時攪拌器 上海雷磁儀器廠;PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;SepctraMan M5酶標儀 美谷分子儀器(上海)有限公司;XS205 DualRange電子天平 梅特勒-托利多集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 DMC對胰脂肪酶的抑制作用

1.2.1.1 溶液配制 Tris緩沖液(0.25 mol/L,含0.25 mol/L NaCl和0.7 mmol/L CaCl2,pH=7.4):稱取7.57 g Tris,3.65 g NaCl和19.4 mg CaCl2加適量水溶解,用鹽酸調pH至7.4,室溫冷卻,轉移至250 mL容量瓶中,加水定容至刻度,搖勻,4 ℃保存。

PL工作液:取50 mg PL加10 mL Tris緩沖液配制得5 mg/mL酶溶液,振搖15 min,18 ℃下4000 r/min離心10 min,分離上清,上清即為PL工作液,置于冰盒中待用,現配現用。

底物pNPB溶液(10 mmol/L):量取17.5 μL pNPB用乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶。

DMC用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,使DMC在體系中最終濃度為2、8、16、32、64 μmol/L,奧利司他作為陽性對照。

1.2.1.2 抑制率測定 采用對硝基苯酚法測定抑制率[19],在48孔板中加入875 μL Tris緩沖液、100 μL PL工作液、20 μL DMC(DMC終濃度為2、8、16、32、64 μmol/L),37 ℃中孵育5 min,然后加入5 μL pNPB溶液,2.5 min后使用酶標儀測定405 nm處的OD值。平行三次。奧利司他(奧利司他終濃度為0.2、1、4、8 μmol/L)代替DMC作為陽性對照,DMSO代替DMC作為不加抑制劑組。運用SPSS 20計算IC50。

抑制率(%)=(AE-AT)/AE×100,式中AE為不加抑制劑組的OD值;AT為加抑制劑組的OD值。

1.2.2 DMC抑制胰脂肪酶的酶動力學特征 精密稱取139.28 mg pNP,用DMSO溶解并定容至10 mL得儲備液,從儲備液中取適量用DMSO稀釋得0.05、0.5、1、1.5、2 mmol/L pNP的DMSO溶液,分別取20 μL pNP的DMSO溶液加975 μL Tris和5 μL乙腈得 0.001、0.01、0.02、0.03、0.04 mmol/L pNP的標準系列溶液,用酶標儀測定其405 nm處的吸光度,以DMSO替代pNP扣除空白,以pNP的標準系列溶液濃度(c)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線,得到線性方程為A=9.008c+0.0009,決定系數R2=0.9999。

對硝基苯酚法測酶活的原理為底物pNPB在PL的催化下加速分解為pNP。在48孔板中加入875 μL Tris緩沖液、100 μL PL工作液、20 μL 不同濃度的DMC溶液(DMC終濃度為0、10、50 μmol/L),37 ℃中孵育5 min,然后分別加入5 μL 不同濃度的pNPB溶液(pNPB終濃度為0.05、0.1、0.2、0.25 mmol/L),每隔0.5 min測一次OD值,根據pNP標準曲線計算pNP生成量,以時間為橫坐標,pNP生成量為縱坐標作圖,斜率即為不同濃度pNPB在PL作用下的反應速率。以底物濃度[S]的倒數為橫坐標,反應速率(V)的倒數為縱坐標,繪制Lineweaver-Burk雙倒數圖,根據對照組(不加DMC)和實驗組(加DMC)直線相交位置推斷DMC對PL的抑制類型。

1.2.3 DMC與PL相互作用的研究

1.2.3.1 DMC對PL熒光光譜的影響 稱取5 mg PL溶解在適量Tris中,振搖15 min,18 ℃下4000 r/min離心5 min,取上清定容至100 mL得1.25×10-6mol/L的PL溶液,取25 mL PL于燒杯中,逐次加入50 μL濃度為1.5 mmol/L的DMC溶液,共滴加7次,DMC終濃度為0、3、6、9、12、15、18、21 μmol/L。以λex=278 nm為激發波長,激發狹縫和發射狹縫分別為5、10 nm,掃描PL以及每滴加一次DMC后PL溶液的熒光光譜,每次測量后將溶液合并至原溶液。

1.2.3.2 DMC對PL的熒光猝滅特性 溶液濃度及配制方法同1.2.3.1,PL濃度為1.25×10-6mol/L,DMC終濃度為3、6、9、12、15、18、21 μmol/L,分別于298和310 K測定DMC對PL熒光強度的影響,根據Stern-Volmer方程[20]判斷猝滅類型:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

式(1)

式中,F0為PL熒光強度,F為加入DMC后PL的熒光強度,KSV為猝滅常數,Kq為雙分子猝滅常數,τ0為沒有猝滅劑時熒光分子的平均壽命,大約為1.59 ns[21],[Q]為抑制劑的濃度。動態猝滅時猝滅劑和熒光物質的激發態分子之間發生碰撞導致熒光強度減弱,溫度升高,碰撞加劇,進而擴散系數增大,KSV增大;靜態猝滅時猝滅劑和熒光物質分子在基態時生成不發光的配合物,溫度升高使配合物穩定性下降,猝滅常數減小。因此,根據不同溫度的KSV的變化判斷DMC對PL的猝滅類型。

為進一步確定猝滅類型,測定1.25×10-5mol/L PL溶液、1.25×10-5mol/L的DMC溶液的紫外吸收光譜及PL與DMC等摩爾混合溶液的紫外吸收光譜。由于動態猝滅不改變基態物質,只對熒光分子的激發態產生影響,因此其吸收光譜并不發生改變;而靜態猝滅中,猝滅劑和熒光物質會形成配合物,從而引起熒光物質的吸收光譜發生改變[22],因此,根據DMC對PL紫外吸收光譜的影響進一步確定DMC對PL的猝滅類型。

1.2.3.3 DMC與PL的相互作用類型 溶液濃度及配制方法同1.2.3.1,PL濃度為1.25×10-6mol/L,DMC終濃度為3、6、9、12、15、18、21 μmol/L,分別于298和310 K測定DMC對PL熒光強度的影響,根據熱力學公式可計算出不同溫度下的熱力學參數ΔH、ΔG、ΔS[23]:

ΔG=-RTlnK

式(2)

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

式(3)

ΔS=(ΔH-ΔG)/T

式(4)

式中R為理想氣體常數。根據ΔH、ΔS、ΔG可以判斷DMC與PL的作用力類型,當ΔH>0且ΔS>0時,作用力為疏水作用力;當ΔH<0且ΔS<0時,作用力為氫鍵和范德華力;當ΔH<0且ΔS>0時,作用力為靜電作用力;ΔG<0,表明相互作用是自發進行的。

1.2.3.4 DMC對PL構象的影響 PL分子中因含酪氨酸及色氨酸等殘基而具有較強的熒光,熒光光譜測定的是氨基酸殘基疊加在一起的熒光強度,而同步熒光[24]可以測定特定氨基酸殘基的熒光特征峰從而知道DMC對PL中氨基酸構象及其所處環境的影響情況。當Δλ=15 nm時,PL的同步熒光光譜顯示的是酪氨酸殘基的特征熒光光譜,當Δλ=60 nm時,PL的同步熒光光譜顯示的為色氨酸殘基的特征熒光光譜,根據DMC對PL同步熒光光譜的最大發射波長變化判斷DMC對PL構象的影響情況。溶液濃度及配制方法同1.2.3.1,PL濃度為1.25×10-6mol/L,DMC終濃度為0、3、6、9、12、15、18、21 μmol/L,激發狹縫和發射狹縫分別為5、10 nm,在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm下測定PL以及每滴加一次DMC后PL溶液的同步熒光光譜。

三維熒光是另一類近幾年新興的常用的熒光分析技術,可以為蛋白大分子構象提供更詳細的信息[25],因此,為了進一步確定DMC對PL構象的影響,測定DMC對PL三維熒光光譜的影響。設置激發波長為240～500 nm,發射波長為240～500 nm,波長間隔5 nm,激發狹縫和發射狹縫分別為5、10 nm,測定1.25×10-6mol/L PL及滴加12 μmol/L DMC的PL溶液的三維熒光光譜。

1.2.4 分子對接 MOE是由加拿大CCG公司開發的分子模擬及藥物設計綜合軟件,實驗采用MOE 2019軟件進行分子對接。選擇DMC作為藥物配體分子,結構在MOE軟件繪制,保存為.moe格式;選擇豬胰脂肪酶(PDI:1ETH)[26]為蛋白受體分子,由蛋白質晶體結構數據庫(http://www.rcsb.org/)提供,經去水,加氫,能量最優等處理,采用MOE-Dock程序對兩者進行對接,模擬分子間的相互作用。

1.3 數據處理

每組實驗均重復三次，結果用平均值M±標準差SD表示。利用SPSS 22.0軟件計算IC50。利用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 DMC對PL的抑制作用及酶動力學研究

2.1.1 DMC對PL的抑制作用結果 由圖1可知,DMC對PL有抑制作用,在實驗濃度范圍內(2～64 μmol/L),DMC濃度越高,對PL抑制作用越強,最大抑制率為54.7%,IC50為50.01±3.56 μmol/L,陽性藥物奧利司他IC50為2.65±0.10 μmol/L。

圖1 DMC對PL活性的影響Fig.1 Effects of DMC on panreatic lipase activity

2.1.2 抑制動力學結果 通過Lineweaver-Burk雙倒數圖直線的相交位置判斷抑制類型,直線交于縱軸為競爭型抑制,直線交于橫軸為非競爭型抑制,直線交于象限內為混合型抑制。實驗結果見圖2,直線交于縱軸,表明DMC對PL的抑制類型屬于競爭型抑制,DMC與底物競爭與PL活性中心結合從而抑制PL活性,DMC濃度增大,PL與底物的親和程度下降,米氏常數(Km)增大,分別為0.0671、0.0785、0.1089 mol/L,最大反應速率(Vmax)不變,為0.0106 mmol/min。

2.2 DMC與PL相互作用的研究

2.2.1 DMC對PL熒光光譜的影響 如圖3所示,DMC的加入使PL熒光強度降低,熒光強度隨DMC濃度增加呈現有規律下降,表明DMC與PL發生相互作用,DMC能使PL發生熒光猝滅。

表1 DMC對胰脂肪酶熒光猝滅Stern-Volmer方程和猝滅常數Table 1 Stern-Volmer equation and constant of fluorescence disappearance of DMC on PL

圖2 DMC的雙倒數Lineweaver-Burk圖Fig.2 Double reciprocal Lineweaver-Burk plot of DMC

圖3 DMC對PL熒光光譜的影響Fig.3 Effect of DMC on PL’s fluorescence spectra注:cPL=1.25×10-6mol/L;a→h表示DMC含量為0、3、6、9、12、15、18、21×10-6 mol/L。

2.2.2 DMC對PL的熒光猝滅特性 熒光猝滅分為動態猝滅和靜態猝滅,可通過不同溫度下的KSV來判斷猝滅類型,結果見表1。結果顯示,溫度升高,KSV增大,表明DMC對PL的猝滅屬于動態猝滅。

圖4 DMC對PL紫外吸收光譜的影響Fig.4 Effect of DMC on UV absorption of PL注:a:DMC與PL 1∶1混合(cDMC=cPL=1.25×10-5 mol/L);b:cPL=1.25×10-5 mol/L。

為進一步確定猝滅類型為動態猝滅,測定了PL及DMC與PL等摩爾混合的紫外吸收光譜,結果見圖4。結果顯示,PL與DMC等摩爾混合后的吸收光譜與PL吸收光譜基本重合,DMC的加入不會改變PL的紫外光譜,進一步說明DMC對PL的猝滅屬于動態猝滅。

2.2.3 DMC與PL的相互作用類型 小分子猝滅劑與蛋白質大分子相互作用力有疏水作用、氫鍵、范德華力、靜電作用力等,根據熱力學公式可計算出不同溫度下的熱力學參數ΔH、ΔG、ΔS,結果如表2。結果顯示ΔH<0,ΔS<0,表明DMC與PL的相互作用力主要為氫鍵和范德華力,ΔG<0,表明兩者之間的相互作用是自發進行的。

表2 不同溫度下DMC與PL相互作用的熱力學參數Table 2 Thermodynamic parameters ofDMC and PL at different temperatures

2.2.4 DMC對PL構象的影響 同步熒光可以測定特定氨基酸殘基的熒光特征峰從而知道DMC對PL中氨基酸構象及其所處環境的影響情況,結果如圖5所示。圖5(a)和5(b)分別是Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時DMC的加入對PL影響的同步熒光圖,由圖5可知,DMC的加入僅使熒光強度降低,最大發射波長基本無變化,表明DMC未使PL構象發生改變。

圖5 DMC對PL同步熒光光譜的影響Fig.5 Effect of DMC on synchronous fluorescence spectra of PL注:(a)Δλ=15 nm;(b)Δλ=60 nm;cDMC(a→h):0、3、6、9、12、15、18、21×10-6 mol/L;cPL=1.25×10-6 mol/L。

表3 PL、PL-DMC體系的三維熒光光譜特征參數Table 3 Three-dimensional fluorescence spectra of DMC and PL-DMC

為了進一步確定DMC 對PL構象的影響,掃描了加入DMC對PL三維熒光光譜的影響。結果如圖6所示,峰p1為PL的色氨酸和酪氨酸殘基的峰,峰p2是瑞利散射峰(λex=λem),峰p3是二級散射峰(λex=2λem),DMC的加入沒有使PL的三維熒光光譜圖增加或減少峰,相關參數見表3,峰p1僅熒光強度下降,而對應的激發波長和發射波長均無變化,進一步表明DMC不會引起PL構象發生變化。

圖6 PL、PL-DMC體系的三維熒光等高線光譜圖Fig.6 Three-dimensional fluorescencespectra of PL and PL-DMC注:cPL=1.25×10-6 mol/L,cDMC=1.2×10-5 mol/L。

2.3 分子對接

分子對接結果如圖7,圖7(a)為對接3D圖,綠色表示DMC分子,標紅的為Ser 153,圖7(b)為對接2D圖,綜合打分-6.3747。PL的活性中心由組氨酸(His)和絲氨酸(Ser)組成,與另一種氨基酸殘基(Asp)一起構成PL催化中心三元組[27]。由圖7可知,DMC與PL有相互作用,與催化位點Ser 153以氫鍵形式結合,因此可以推斷,DMC可以與底物競爭結合酶的活性中心而抑制PL活性,從而抑制了底物的降解,有利于預防和治療肥胖,屬于PL的競爭性抑制劑。上述結果與酶抑制實驗和熒光實驗結果均相符。

圖7 DMC與PL分子對接圖Fig.7 Molecular docking model of DMC and PL

3 結論

采用水翁花蕾中分離得到的黃酮單體DMC,研究了其對PL的抑制作用,IC50為50.01±3.56 μmol/L,酶動力學表明DMC是PL的競爭型抑制劑;光譜實驗表明DMC通過與PL激發態發生碰撞的動態猝滅方式使PL發生熒光猝滅,二者作用力為氫鍵和范德華力且反應自發進行,DMC不會改變PL構象。分子對接進一步闡述DMC通過與PL的催化位點Ser 153氫鍵結合而抑制PL活性。此研究可為DMC作為PL抑制劑開發提供相關理論參考。