響應面法優化富硒粗毛纖孔菌菌絲生長培養基成分

(福建生物工程職業技術學院,福建福州 350007)

粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)屬于銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)纖孔菌屬(Inonotus),又名粗毛黃褐孔,是一種珍惜的藥用真菌[1]。該菌以寄生為主,主要分布于新疆、寧夏、內蒙古、黑龍江、吉林等北溫帶地區[2-3]。該菌在民間作為“桑黃”采集入藥,常用于糖尿病、痛風、關節炎等疾病[2]。經國內專家學者對該菌進行考證,發現該菌即為古代中藥“桑黃”[4-5]。此外,大量研究表明該菌具有多種生物活性,如抗病毒[6]、抗氧化[7-9]、抗腫瘤[10-13]、降血脂[14]、活血化瘀[15-16]、保肝[17]及提高免疫力[18]等作用。目前對該菌的研究主要集中在鑒定[9,19]、菌種篩選[20]、栽培[21-22]以及多糖[7]、酚類化合物[9]、三萜[14]等生物活性代謝物及小分子化合物[11]的提取及研究方面。

已有研究表明,食藥用菌如平菇、雙孢菇、雨傘菇、草菇、榆黃菇、牛肝菌、靈芝等具有轉化無機硒并積累有機硒元素的有效機制[39-44]。理論上野生食藥用菌中硒含量應具較高水平,但實際上大多數野生食藥用物種都處于硒缺乏狀態,每克子實體干重含硒濃度小于1 μg[45]。研究表明,食藥用菌積累微量營養素的能力受土壤基質、真菌種類和元素類型的影響[46],且生長基質中硒的濃度也會阻礙食藥用菌菌絲的生長和子實體的形成[47-48]。因此,了解食藥用菌對無機硒的耐受度及合理的富硒培養基成分是生產富硒功能性食藥用菌的前提條件?，F如今,關于粗毛纖孔菌對無機硒的耐受度及富硒培養基成分還鮮有報道。本研究通過響應面法對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長培養基成分進行優化,旨在減少無機硒對粗毛纖孔菌的抑制作用,最大程度保證該菌菌絲能夠在富硒的同時,正常甚至更好地生長,提高富硒菌絲的產量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗毛纖孔菌(Inonotushispidus) 福建農林大學國家菌草工程技術研究中心提供;亞硒酸鈉 西亞試劑公司;葡萄糖 西隴科學股份有限公司;硫酸鎂 阿拉丁工業有限公司;磷酸二氫鉀 西隴科學股份有限公司;VB1山東西亞化學工業有限公司;濃硝酸 南京化學試劑股份有限公司;母種培養基 為改良PDA培養基:馬鈴薯200 g/L、葡萄糖30 g/L、硫酸鎂0.75 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、維生素B1(VB1)1 mg/L、瓊脂15 g/L。

LDZX-50FBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;SW-CJ-2A超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;HPX-9272MBE電熱恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司;X-seriesⅡ電感耦合等離子體質譜儀 Thermo股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 母種活化及接種 取粗毛纖孔菌斜面母種約0.25 cm2接種于改良PDA平板中,倒置于恒溫培養箱30 ℃暗光培養。待菌絲生長覆蓋至平板2/3左右,于菌落邊緣取直徑為0.6 cm活化菌塊作為后續實驗母種。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 硒濃度對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 以改良PDA培養基為基礎,向其中添加1 mg/mL亞硒酸鈉溶液,通過梯度稀釋法配制硒濃度分別為2.33、4.66、9.31、18.63、37.25、74.5、149、298和596 mg/L的供試培養基,以無硒添加的改良PDA培養基為對照(CK)。將供試培養基注入滅菌(121 ℃、20 min)后的培養皿,每皿約25 mL,冷卻凝固后接入直徑為0.6 cm的活化菌塊,每個濃度5個重復。30 ℃暗光倒置培養8 d后,觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,使用游標卡尺利用十字交叉法精確測量菌落生長直徑,記錄數據。

1.2.2.2 常規培養料對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 以改良PDA培養基為基礎,分別配制麩皮、玉米粉、大米、豆粉培養基,用以篩選粗毛纖孔菌菌絲最適生長培養料。其中:

麩皮培養基:麩皮50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。

玉米粉培養基:玉米粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。

大米培養基:大米50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。

豆粉培養基:豆粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,pH自然。

每種培養基5個重復,30 ℃暗光倒置培養8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數據。

1.2.2.3 補充碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 以改良PDA培養基為基礎,將培養基中的葡萄糖(30 g/L)調整為等量蔗糖、乳糖、果糖或海藻糖,每種培養基5個重復,30 ℃暗光倒置培養8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數據。

1.2.2.4 培養基pH對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 多數食藥用菌適宜在微酸和中性pH條件下生長,因此,以改良PDA培養基為基礎,將培養基pH分別調整為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,每種培養基5個重復,30 ℃暗光倒置培養8 d后觀察粗毛纖孔菌菌絲生長情況,測量并記錄數據。

1.2.3 Box-Behnken design優化粗毛纖孔菌菌絲 富硒培養基配方為考察培養基各成分與外源硒對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響及其之間的交互效應,以單因素實驗結果為依據,以粗毛纖孔菌菌絲生長速度為指標(Y),在最適pH條件下,采用Box-Behnken模型設計三因素、三水平組合實驗(表1),對結果進行響應面分析,得到最優響應Y值,從而得到最佳富硒粗毛纖孔菌菌絲培養基配方。

表1 BBD實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of BBD experiment

1.2.4 菌絲生長情況檢測 菌絲生長情況通過菌絲平均生長速度進行評估,利用十字交叉法對培養后平板內粗毛纖孔菌菌絲進行測量,測量所得菌絲生長直徑除以培養時間即為菌絲生長速度,其中菌絲生長直徑為測量獲得總直徑減去初始直徑。最大耐受濃度(MTC)指不引起受試對象出現死亡的最高計量,即當實驗濃度處于最大耐受濃度時,菌絲體有生長;而實驗濃度高于MTC時,則生長被完全抑制。

1.2.5 富硒粗毛纖孔菌菌絲硒含量的測定 參考食品安全國家標準(GB 5009.268-2016)[49],采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS),精確稱取富硒粗毛纖孔菌菌絲干試樣0.5 g于聚四氟乙烯消解內罐,加5 mL硝酸浸泡過夜。封好消解罐放入恒溫干燥箱,160 ℃保持6 h,自然冷卻至室溫后打開加熱趕酸至近干,將消化液吸入25 mL容量瓶中,用少量1%硝酸溶液洗滌內罐和內蓋3次,合并洗液,用1%硝酸定容,混勻備用。將試樣溶液與空白溶液分別注入電感耦合等離子體質譜儀中,測定硒元素含量。

1.3 數據處理

利用DPS 7.05軟件對實驗數據進行隨機單因素方差分析,采用Tukey多重比較法進行顯著性檢驗。利用Design-Expert 8. 06軟件對響應面實驗進行設計、分析并繪制響應曲面。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 硒濃度對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 由圖1可知,粗毛纖孔菌菌絲的生長情況受外源硒影響較大。當培養基中所添加硒濃度≤18.63 mg/L時,粗毛纖孔菌菌絲的生長速度與對照組無顯著性差異(P>0.05)。隨處理濃度的升高,當硒濃度≥37.25 mg/L時,粗毛纖孔菌菌絲生長開始受到明顯的抑制,其生長速度顯著性降低(P<0.05)。當硒濃度達到298 mg/L時,粗毛纖孔菌菌絲略有生長,其生長速度與零生長組(即完全抑制組,硒濃度為596 mg/L)無顯著性差異(P>0.05)。因此,粗毛纖孔菌菌絲對硒的最大耐受濃度為298～596 mg/L,而后續實驗中硒的濃度以18.63 mg/L為宜。

圖1 硒濃度對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響Fig.1 Effect of Se concentration on themycelia growth rate of I.hispidus注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 常規培養料對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 由圖2可知,粗毛纖孔菌菌絲在常規培養料配制的培養基上均能生長,但其菌絲生長速度存在顯著性差異(P<0.05),且菌絲稠密度相差較大。粗毛纖孔菌在麩皮培養基上生長效果最好,其菌絲的生長速度可達到6.6 mm/d,且菌絲稠密度最高;其次為改良PDA培養基;以玉米粉、大米、豆粉為培養料時,其菌絲生長速度顯著降低(P<0.05),且菌絲稠密度明顯弱于改良PDA培養基。此外,粗毛纖孔菌菌絲對玉米粉的可利用度最低。因此,后續實驗選取麩皮為培養基。

圖2 常規培養料對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響Fig.2 Effect of the principal components of culture mediumon the mycelia growth rate of I.hispidus注:菌絲的稠密度:+++:CK程度,++++:高于CK程度,++:低于CK程度,+:低于++程度;圖3、圖6同。

2.1.3 補充碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 如圖3所示,粗毛纖孔菌對不同補充碳源的可利用度不同,以不同類型的補充碳源作為培養基成分,其菌絲生長速度存在顯著性差異(P<0.05),且菌絲稠密度相差較大。當以葡萄糖作為補充碳源時,粗毛纖孔菌菌絲生長速度最高,菌絲稠密度最佳;以蔗糖、果糖、海藻糖作為補充碳源時,其菌絲生長速度稍低,菌絲稠密度則明顯弱于葡萄糖的效果。粗毛纖孔菌菌絲對乳糖的可利用度最低。因此,后續實驗選取葡萄糖作為補充碳源。

圖3 補充碳源對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響Fig.3 Effect of supplementary carbon sourceon the mycelia growth rate of I. hispidus

2.1.4 pH對粗毛纖孔菌菌絲生長的影響 由圖4可知,當pH條件偏酸時,該粗毛纖孔菌菌絲生長速度偏低;當pH處于6.5～7.5時,該粗毛纖孔菌菌絲生長速度先隨pH的增大而增加,再隨pH的增大而降低,于pH7.0時達到最佳,表明該粗毛纖孔菌菌株在中性pH條件下長勢最好。因此,后續實驗中pH條件以7.0為宜。

圖4 pH對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響Fig.4 Effect of pH on the mycelia growth rate of I.hispidus

2.2 響應面法優化粗毛纖孔菌菌絲富硒培養基配方

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析 通過Design-Expert 8.06軟件設計響應面試驗,基于單因素結果,以麩皮(X1)、葡萄糖(X2)及硒(X3)為自變量,以粗毛纖孔菌菌絲生長速率平均值為響應值(Y),進行響應面試驗,試驗方案與結果見表2。通過Design-Expert 8.06對表2結果進行分析,得到的3因素與菌絲生長速度(Y)之間的回歸模型可以表述為:

表2 BBD實驗設計及結果Table 2 Design matrix and the results of Box-Behnken

2.2.2 各因素交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的響應面分析 為考慮交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響,在另一因素條件固定不變(編碼水平為零)的情況下,分析兩兩因素交互作用對其菌絲生長速度的影響。通過Design-Expert 8.06軟件處理上述實驗設計得到3D響應曲面圖和等高線分析圖(圖5),可以直觀地看出各個因子之間的交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度的影響。響應面分析中,等高線的形狀可以反映兩因素間交互作應對響應值影響的強弱大小,圓形表示不顯著,橢圓形則與之相反;等高線的稀疏情況反映響應面圖像的平陡情況。從圖5可以看出,兩兩因素之間的等高線形狀均為橢圓形,表明其交互作用顯著。由圖5A可知,粗毛纖孔菌菌絲生長速度(Y)隨麩皮添加量(X1)和葡萄糖添加量(X2)的增加而增加;由圖5B可見,粗毛纖孔菌菌絲生長速度(Y)隨麩皮添加量(X1)的增加和硒添加量(X3)的減小而增加;在較小硒添加(X3)情況下,麩皮添加量(X1)

表3 菌絲生長速度響應模型的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model of mycelia growth rate

圖5 兩兩因素交互作用對粗毛纖孔菌菌絲生長速度影響的響應曲面圖和等高線分析圖Fig.5 The interactive effects between(A)bran and glucose,(B)bran and Se,(C)glucose and Seon I. hispidus mycelia growth rate showed by 3-D response surface and 2-D contour plots

在很大的范圍內均可取到較大的Y值;圖5C也表現出與圖5B相同的趨勢,表明硒添加對粗毛纖孔菌菌絲生長不利,但可以通過其他因素與其交互作用減少其對粗毛纖孔菌菌絲生長抑制作用的影響。綜合各圖,各因素之間的交互作用與回歸模型的方差分析結果相吻合。由Design-Expert 8.06軟件分析得到最大響應值(Y)時最優培養基配方為:麩皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L,此時富硒粗毛纖孔菌菌絲生長速度預測值為8.19 mm/d。

2.3 驗證實驗

為了檢測響應面結果的準確性,以改良PDA培養基為陰性對照,以等量硒添加改良PDA培養基為陽性對照,配制上述最優培養基配方進行富硒粗毛纖孔菌菌絲培養實驗,每組八個重復,測得粗毛纖孔菌及富硒粗毛纖孔菌菌絲生長速度見圖6。響應面優化培養基實測值8.41 mm/d>預測值8.19 mm/d>改良PDA實測值6.79 mm/d>等量硒添加改良PDA實測值 4.28 mm/d,且優化后的富硒培養基培養的粗毛纖孔菌菌絲的稠密度更高(圖6)。與等量硒添加改良PDA相比,以響應面優化培養基進行培養,粗毛纖孔菌菌絲生長速度提高了0.965倍。此外,通過電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)對最優培養基培養菌絲的硒富集量進行檢測,測得富硒粗毛纖孔菌菌絲硒富集量為31.584 μg/g。說明采用響應面法獲得的模型能較好地預測富硒粗毛纖孔菌菌絲的生長情況,該富硒培養基配方可以減少外源硒對粗毛纖孔菌菌絲抑制作用的影響,使其能夠在富硒的同時正常甚至更好地生長,提高富硒菌絲的產量,具有一定的實用價值。

圖6 驗證實驗結果Fig.6 The results of verification test

3 結論

首次針對粗毛纖孔菌對無機硒的耐受度進行探索,發現該菌菌絲的生長情況受外源硒影響較大,當硒濃度達到或大于37.25 mg/L時,該菌菌絲生長受到顯著的抑制作用(P<0.05)。因此,本研究通過響應面法對該菌富硒培養基成分進行優化,旨在保證該菌菌絲在正常生長情況下合理富集、積累并轉化無機硒為有機硒,提高富硒粗毛纖孔菌菌絲的產量。

經響應面法優化得到富硒粗毛纖孔菌菌絲生長最優培養基配方為:麩皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、瓊脂15 g/L。其中葡萄糖添加量、麩皮添加量和硒添加量對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長均具有極顯著作用;且麩皮與葡萄糖、麩皮與硒添加、葡萄糖與硒添加之間的兩兩交互作用對富硒粗毛纖孔菌菌絲生長均具有顯著作用(P<0.01)。在此條件下,富硒粗毛纖孔菌實際菌絲生長速度達到8.41 mm/d,與預測值相符,且硒富集量達到31.584 μg/g。說明采用響應面法優化獲得的富硒粗毛纖孔菌菌絲生長培養基配方具有一定的實用價值。

該配方通過培養基內因素間的交互作用減少了外源硒對粗毛纖孔菌菌絲生長抑制作用的影響,確定了合理的硒添加比例,與等量硒添加改良PDA相比,優化后粗毛纖孔菌菌絲生長速度提高了約1倍(0.965倍);與同配方無硒添加培養基相比,菌絲硒含量增加為31.584 μg/g。國際營養聯合會規定缺硒人群每人每天食用硒量不少于50 μg,每人每天食用本研究富硒粗毛纖孔菌制品1.58 g即可完全滿足此要求。本研究在硒抑制與菌絲生長之間找到平衡點,獲得了最優配方,為富硒粗毛纖孔菌菌絲體的大量制備、富硒粗毛纖孔菌子實體的栽培及其它后續研究提供了理論依據。