三種L蘇氨酸的測定方法比較

李澤宇,高 利,車方怡,劉水永恒,灑榮波,張顯忠,史仁玖

(山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)生命科學學院,山東泰安 271016)

L-蘇氨酸(L-Threonine,Thr),分子式C4H9NO3,相對分子量119.12,白色結晶或結晶粉末,是人體的必需氨基酸之一[1-2]。L-蘇氨酸作為八種必需氨基酸之一,廣泛地應用在食品[3-4]、飼料[5]、醫藥[6]、化妝品[3]和保健品[7-9]等多個領域。L-蘇氨酸的生產方法主要有發酵法、蛋白質水解法和化學合成法3種。微生物發酵法生產蘇氨酸,因其工藝簡單,成本低廉等優點已成為目前主流方法[10]。

目前,L-蘇氨酸的測定方法主要有氨基酸分析儀法、紙層析法[11-13]、薄層層析法[14-15]、高效液相法[16-18]、荷移比色法[19]等。這些方法分析的原理,分析所需時間、成本、精確度及優缺點都有所不同。氨基酸分析儀法檢測效果最好,可分離的氨基酸種類最多,通常作為氨基酸檢測的標準。然而氨基酸分析儀只能用來檢測氨基酸,且使用的試劑和色譜柱價格昂貴,普通實驗室不易擁有。紙層析法分離種類較少的氨基酸效果較好,成本低,一般實驗室均可進行,但在分離多種氨基酸和極性相近的氨基酸效果較差。薄層層析法同紙層析法類似,適合分離種類較少的氨基酸,成本低,在分離多種氨基酸和極性相近的氨基酸效果較差[11],與紙層析法相互補可以低成本分離部分常用氨基酸。高效液相法檢測效果好,雖檢測精度和可分離的氨基酸種類不及與氨基酸分析儀但已滿足絕大部分精密實驗的需求。價格相對于氨基酸分析儀低很多,并可以測量其他種類的物質,一機多用。缺點是衍生試劑對人體有害,需要注意操作,色譜柱壽命較短,需要經常更換色譜柱。荷移比色法分離效果較好[19],但該方法報道的文獻與研究較少,優缺點與層析法類似,故本實驗未選取。

針對以上方法的優缺點,本研究選擇了紙層析法、薄層層析法、高效液相PITC柱前衍生法進行研究比較。以上三種方法廣泛應用并具有明確的代表性。紙層析法和薄層層析法成本低廉,對實驗室要求低,一般實驗室均可進行,非常適合菌種的初步選育。高效液相法精確快速,成本相對于氨基酸分析儀較低,且高校液相色譜儀用途多樣,可用于測定分析多種物質。本文選取的層析濾紙、薄層層析板均為國產,價格較低。本文的高效液相法選擇了PITC(異硫氰酸苯酯)柱前衍生法,PITC法相對于其他柱前衍生法樣品保存時間長,價格較低,可使用氨基酸分析柱或普通C18柱測定,色譜柱也選擇了價格較為便宜的色譜柱。在以往的研究中,將方法數據進行對比的較少。本研究將這三種有代表性的檢測方法進行方法學的評價,通過對10份發酵液進行L-蘇氨酸含量檢測與數據分析,歸納對比了不同方法之間的相關性、應用特點和不足,為L-蘇氨酸含量的定性和定量分析以及拓展延伸至其它氨基酸提供技術信息和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同的氨基酸發酵液10份 實驗室自制(某基因工程菌株E.coli,中藥生物技術實驗室保存);PITC、三乙胺、無水乙酸鈉、水合茚三酮和L-蘇氨酸標準品 索萊寶科技有限公司;正己烷、甲醇、乙腈和丙酮 天津永大有限公司;硫酸銅、正丁醇、冰乙酸和乙醇 天津凱通化學試劑有限公司;硅膠層析板 煙臺江友有限公司;新華三號層析濾紙 廣州紫宸化玻儀器;除甲醇乙腈為色譜純外，其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀 美國安捷倫公司,由G1311B高壓四元梯度泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器及安捷倫色譜工作站組成;SMA色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm) 天津普祥科技有限公司;V1100D紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液樣品的制備 取100 μL 1.1中所述菌株的甘油管保存液接入100 mL LB培養基,培養至OD值0.6～0.8,以6%接種量接入搖瓶發酵培養基。蔗糖含量分別為30和45 g/L,其他成分為硫酸銨10 g/L,碳酸鈣35 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L,硫酸鎂2 g/L,卡那霉素50 mg/L,甜菜堿1.5 g/L,一水硫酸錳20 mg/L,七水硫酸亞鐵20 mg/L。110 ℃,10 min滅菌,初始pH6.8～7.0,37 ℃,200 r/min培養。以添加30 g/L蔗糖培養30、34、38、42和46 h作為樣品4、5、2、3和1。以添加45 g/L蔗糖培養48、52、56、60和64 h作為樣品6、7、10、8和9。

1.2.2 高效液相法(PITC柱前衍生)

1.2.2.1 溶液配制 PITC乙腈溶液(0.1 mol/L):取0.3 mL PITC置于25 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,4 ℃保存。三乙胺乙腈溶液(0.1 mol/L)取1.3 mL三乙胺置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,4 ℃保存。

流動相A:80%乙腈溶液(800 mL乙腈加200 mL超純水),超聲脫氣。流動相B:97∶3 (V/V)乙酸鈉乙腈溶液(15.2 g無水乙酸鈉加超純水1850 mL溶解,冰醋酸調pH至6.5,加乙腈140 mL),超聲脫氣。

標準品溶液:精確稱取1.0 mg L-蘇氨酸標準品,加0.1 mol/L鹽酸溶解并定容至2 mL,配制成50 g/L L-蘇氨酸母液。通過逐級稀釋,配制為0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/L的系列溶液。

1.2.2.2 樣品配制 取1 mL發酵液,12000 r/min離心2 min,用超純水稀釋50倍,備用。

1.2.2.3 標準品樣品衍生處理 取L-蘇氨酸標準品,稀釋后的發酵液各200 μL,加入PITC乙腈溶液,三乙胺乙腈溶液各100 μL,混勻,室溫放置1 h,加入正己烷400 μL,充分振搖混勻,放置15 min,取下層溶液(不要吸入上層正己烷溶液),重復2次,12000 r/min離心5 min,0.45 μm濾膜過濾。

1.2.2.4 色譜條件 流動相:A為乙酸鈉乙腈93∶7 (V/V)溶液,流動相B為80%乙腈;梯度洗脫程序如表1;流速:1 mL/min;柱溫度:40 ℃;二極管陣列檢測波長:254 nm;進樣量:5 μL[17-18]。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.2.5 標準曲線制作 將0.0625、0.125、0.25、0.5、1 g/L衍生處理后的L-蘇氨酸標準溶液按上述HPLC色譜條件進行分析,以標準品濃度X(g/L)為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2.6 含量計算 每樣品重復5次取平均值,以樣品分析的色譜峰面積和標準曲線計算出濃度(g/L),乘以稀釋倍數即為含量(g/L)。

1.2.3 紙層析法

1.2.3.1 溶液配制 顯色液:0.5%茚三酮溶液(0.5 g茚三酮用正丁醇定容至100 mL充分溶解)。展開層析顯色液:正丁醇∶顯色液∶冰乙酸∶水=10∶2∶3∶5 (V/V)。洗脫液:0.1% CuSO4∶75%乙醇=2∶38 (V/V)。

表2 L-蘇氨酸不同含量測定方法間的比較Table 2 Comparison of different methods for determination of L-threonine

標準品配制:精確稱取1.0 mg L-蘇氨酸標準品,加超純水溶解并定容至2 mL,配制成50 g/L L-蘇氨酸母液,通過逐級稀釋,配制為1、2、3、4、5 g/L的系列溶液。

樣品配制:取1 mL發酵液,12000 r/min離心2 min,用超純水稀釋10倍,備用。

1.2.3.2 分析方法 將新華3號層析濾紙裁剪至長20 cm,寬10 cm。距離底端2 cm用鉛筆劃一條線,在線上間隔2 cm使用微量移液槍點樣,每次2.5 μL,點樣后使用吹風機吹干,連續點樣2次。加入約20 mL展開層析液,于層析缸內平衡1 h后放下濾紙,使用大頭針固定于層析缸。層析1.5 h,放入烘箱105 ℃干燥顯色10 min,剪下顯色斑點(每個樣品剪下的面積要相同)。每個顯色斑點分別置于獨立試管中,加洗脫液6 mL,超聲40 ℃洗脫30 min,立即使用分光光度計檢測510 nm下吸光度。每個樣品(標準品)重復5次[12,15]。

1.2.3.3 標準曲線制作 將1、2、3、4、5 g/L的L-蘇氨酸標準溶液按上述方法進行分析,以標準品濃度X(g/L)為橫坐標,吸光度Y為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.3.4 L-蘇氨酸含量計算 每個樣品數據取平均值。以樣品分析的吸光度和標準曲線計算出濃度(g/L),乘以稀釋倍數即為含量(g/L)。

1.2.4 薄層層析法

1.2.4.1 溶液配制 同紙層析法。

1.2.4.2 分析方法 將薄層層析板切割至長16 cm,寬10 cm。距離底端2 cm用鉛筆劃一條線,在線上間隔2 cm使用微量移液槍點樣,每次2.5 μL,點樣后使用吹風機吹干,連續點樣2次。于層析缸內層析1.5 h后放入烘箱105 ℃干燥顯色10 min,刮下顯色斑點(每個樣品刮下的顯色粉末要大致相同)。每個樣品的顯色粉末分別加入獨立試管中,加洗脫液6 mL,40 ℃振動洗脫30 min,靜置2 min,立即使用分光光度計檢測510 nm下吸光度。每個樣品(標準品)重復5次[14-15]。

1.2.4.3 標準曲線制作 同紙層析法。

1.2.4.4 含量計算 同紙層析法。

1.2.5 方法穩定性實驗

1.2.5.1 紙層析法條件穩定性 將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸標準溶液顯色斑點顯色后置于40 ℃培養箱0～60 min,按照1.2.3后續步驟測定不同放置時間的吸光度。將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸標準溶液顯色斑點顯色后置于40 ℃培養箱30 min,按照1.2.3后續步驟測定505～515 nm波長的吸光度。

1.2.5.2 薄層層析法條件穩定性 將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸標準溶液顯色斑點顯色后置于40 ℃培養箱0～60 min,按照1.2.3后續步驟測定不同放置時間的吸光度。將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸標準溶液顯色斑點顯色后置于40 ℃培養箱30 min,按照1.2.4后續步驟測定505～515 nm波長的吸光度。

1.2.5.3 液相PITC衍生法條件穩定性 將全新配制的1 g/L L-蘇氨酸衍生后的標準溶液于4 ℃下放置0～7 d,測定其峰面積。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel等專業軟件來處理數據。

2 結果與分析

2.1 三種分析方法的比較

2.1.1 回歸方程與線性相關系數 采用3種L-蘇氨酸定量方法,配制L-蘇氨酸標準溶液進行分析,根據測定結果制成各方法的標準曲線,回歸方程見表2。由表2可知,幾種方法在有效范圍內L-蘇氨酸響應值(Y)與樣品的質量濃度(X)間有良好的線性關系,其中紙層析法和薄層層析法的決定系數在0.99以上,液相PITC柱前衍生法的決定系數在0.999以上。標準品、樣品紙層析、薄層層析、液相PITC三種方法測定的結果見圖1～圖6。

圖1 紙層析法標準品層析圖Fig.1 The standard productchromatogram of paper chromatography注:1～5分別為5、4、3、2、1 g/L L-蘇氨酸標準品;圖2同。

圖2 薄層層析法標準品層析圖Fig.2 The standard product chromatogram of TLC

圖3 PITC法標準品色譜圖Fig.3 The standard product chromatogram of PITC method

圖4 紙層析法樣品層析圖Fig.4 The sample productchromatogram of paper chromatography注:1～5分別為樣品1～5;圖5同。

圖5 薄層層析法樣品圖Fig.5 The sample product chromatogram of TLC

圖6 PITC法測定樣品的色譜圖Fig.6 The sample product chromatogram of PITC method

2.1.2 靈敏度 由表2可知,液相PITC柱前衍生法的檢出限最低,為1.2 μg/L,紙層析法其次,為5 μg/L,薄層層析法最高,為7 μg/L。因此,在靈敏度方面,液相PITC柱前衍生法>紙層析法>薄層層析法。

2.1.3 精密度 1 g/L標準品重復測定(n=5),考察方法的精密度,由表2中的結果可見，液相PITC衍生法的精密度最高,為0.3%。紙層析和薄層層析法的精密度相近,分別為4.1%和3.4%。

2.2 各方法條件穩定性實驗

2.2.1 紙層析法和薄層層析法條件穩定性優化結果 結果如圖7、圖8和表3。由表3可知,在不同波長條件下,紙層析法的P>0.05,無顯著性差異,薄層層析法0.010.05,無顯著性差異,薄層層析法P>0.05,無顯著性差異。結合圖、表結果,在實際操作中兩種方法應選取510 nm,30 min測定條件為佳。

圖7 1 g/L L-蘇氨酸標準品在不同波長下的吸光度Fig.7 Absorbance of 1 g/L L-threoninestandard at different wavelengths

圖8 1 g/L L-蘇氨酸標準品在不同放置時間下的吸光度Fig.8 Absorbance of 1 g/L L-threoninestandard at different placement times

2.2.2 液相PITC衍生法條件穩定性優化 結果如圖9和表4。在圖9中可以看出,在3 d之后峰面積下降明顯加快。由表4可知0～3 d的P>0.05,無顯著性差異;4～7 d的P<0.01,有極顯著性差異。因此在衍生之后應在3 d之內測定結果較好。

表3 紙層析法和薄層層析法條件穩定性優化結果Table 3 Optimization results of paper chromatography and thin layer chromatography for conditional stability

圖9 1 g/L衍生后L-蘇氨酸標準溶液在不同放置天數下的峰面積Fig.9 Peak area of L-threonine standard solutionafter 1 g/L derivatization under different days of placement

表4 液相PITC衍生法條件穩定性優化結果Table 4 Optimization results of PITC derivative methodfor liquid phase conditional stability

2.2.3 不同方法測定10份樣品的L-蘇氨酸含量的結果及分析 不同方法測定10份樣品的結果見表5。由表6可知,在每組數據的方差分析中,紙層析和薄層層析法方差較大,PITC法方差較小,說明PITC法的精確度最高,紙層析法和薄層層析法的精度次之。

2.3 不同方法的樣品加標回收率

準確稱取質量為0.2、0.6、1.2 g的L-蘇氨酸標準品,加入到前面檢測含量最低和最高的兩組樣品(第4組和第9組樣品)中,測定三種方法的平均回收率,如表7所示,測得三種方法的平均回收率分別為95.60%、95.10%和99.30%。

表5 3種L-蘇氨酸測定方法對樣品的檢測結果(n=5)Table 5 Test results of three L-threonine determination methods on actual samples(n=5)

續表

表6 L-蘇氨酸含量測定結果Table 6 Determination results of L-threonine

表7 不同方法的樣品加標回收率Table 7 Recovery rate of spiked samples by different methods

3 結論與討論

氨基酸檢測的方法多種多樣,不同的方法的精度、成本、時間都有所區別。根據不同的檢測需求與實驗室條件,可選擇不同的檢測方法。在所選擇的三種方法中,紙層析法成本最低,一般的實驗室均可進行,本實驗所使用的層析濾紙也選擇了成本較低的國產濾紙。紙層析法在測定純度好的L-蘇氨酸標準品時,線性、RSD和回收率均排在第三位,在測定混合樣品時回收率排在第二位,說明紙層析法在成分較為復雜的樣品時優于薄層層析法。在紙層析法實驗中,將顯色劑與展開劑合一,這樣做不僅減少了顯色后的花板現象,便于觀察結果,也減少了誤差和層析時間。展開劑和層析液合一后的層析時間可以縮短為90 min,節省了操作時間,同時展開劑和層析液合一也大大方便了操作。在層析液選取方面,比較了不同層析比例,最終選取了實驗所用比例。在條件優化方面,選定了510 nm顯色波長和盡快測定。該方法的優點是成本和對實驗室條件要求低。缺點是分離氨基酸種類多或者極性相近的氨基酸混合溶液的效果不好。在后續實驗中,嘗試使用該方法分離多種氨基酸混合標準溶液,效果較差。并結合部分文獻分離容易分開的氨基酸種類的混合溶液,雖取得了一定成功,但分離度較差,各氨基酸均有拖尾[20-21]。因此,在使用紙層析法時,對于不同組分的混合溶液,應選取不同的展開劑和條件。

薄層層析法相比于紙層析法,在檢測純度好的L-蘇氨酸標準品時,線性、RSD和回收率均好于紙層析法。然而在測定混合樣品時,發現其不如紙層析法,原因可能與硅膠的吸附有關,且本實驗所使用的層析板為成本較低的國產層析板。在日后的實驗中,考慮采用較好的薄層板進行實驗。同理,紙層析法也可采用高質量的層析紙進行?？紤]到好的薄層板和層析紙價格較貴,不符合低成本測定L-蘇氨酸含量的特點,故本實驗沒有進行比較。在薄層層析法實驗中,也將顯色劑和展開劑合一,取得了和紙層析法優化后相近效果。在層析液選取方面,比較了不同的層析比例,發現紙層析法所用比例和水∶乙醇∶冰醋酸1∶6∶0.5 (V/V/V)[14]效果接近,為了實驗和后續優化條件的方便,故選取同紙層析法一樣的層析液。在條件優化方面,顯色波長和檢測時間與紙層析法接近,故選取510 nm和盡快測定。該方法在洗脫后需要靜置一定時間,以便部分由于震蕩浮起的硅膠粉末沉降。該方法的主要優點是成本低和對實驗室要求低,與紙層析法互補可低成本檢測很多氨基酸。缺點和紙層析法類似,分離氨基酸種類多或者極性相近的氨基酸混合溶液的效果不好。在后續實驗中同樣嘗試使用該方法分離多種氨基酸混合標準溶液及結合文獻分離部分容易分開的氨基酸種類的混合溶液,結果與紙層析法相似,但容易分開的氨基酸種類不相同[22]。因此,紙層析法和薄層層析法可以互補來低成本測定部分種類的氨基酸混合溶液。目前,一些研究者使用納米顯色劑來對薄層層析法進行進行快速薄層直讀顯色分析[23],這種方法相比于傳統方法快速高效,值得在以后的實驗中深入研究。

高效液相PITC衍生法相比于其他兩種方法最精確,當然成本也最高,不過相比于功能單一的氨基酸測定儀,高效液相色譜儀可以一機多用。在預實驗中,也進行了其他衍生方法的實驗[24-27],考慮到成本和樣品保存,最終選擇了PITC作為衍生劑。在色譜條件方面,參考了色譜柱自帶說明書和文獻,比對了不同的條件,最終選擇了該色譜方法。在實際操作中,應根據自身色譜柱選擇合適的分析方法。使用的色譜柱雖然是氨基酸分析柱,但價格較低,約3000元左右,該價格與普通C18色譜柱相當。該方法優點是所用的試劑相比于其他衍生試劑,保存時間長,價格較低,在分離多種按氨基酸混合溶液時分離度較好。缺點是該方法不能用于在線衍生,以及殘留在分析柱中的痕量衍生劑會縮短分析柱壽命[24]。在后續實驗中,使用該方法分離氨基酸混合標準溶液,效果較好。但在參考其他分離方法的基礎上[28-30],分離種類很多的混合標準溶液時效果遠不如氨基酸分析儀。因此,在分離種類很多,一般大于17種常用氨基酸種類的混合溶液時,建議使用氨基酸分析儀進行檢測。

在誤差減少方面,紙層析法和薄層層析法后期采用了去掉極值取平均值的方法來減少誤差,同時,在這兩種實驗操作過程中,應注意以下幾點,可有效減少誤差:操作過程中全程戴干凈手套;所有實驗接觸品都應用超純水水清洗干凈(水可有效溶解L-蘇氨酸及大部分其他氨基酸);點樣尺寸不宜過大;層析液現用現配;每次測定完的儀器都應充分沖洗;薄層層析板和層析濾紙要保持干凈,鑒于目前很多運輸過程中的污染,建議使用中間的幾張或幾層層析板;操作過程要迅速等。在高效液相PITC柱前衍生法中,所有消耗品應一次性使用,包括進樣瓶、進樣瓶蓋(包括瓶墊)、內插管,一次性注射器等,每次進樣完畢后使用乙腈進行洗針,洗針瓶一次性使用等。雖然PITC柱子前衍生法的衍生溶液很穩定,但在后續實驗中,作者發現也會發生微小變化,因此在衍生后應盡快測定,以減少誤差。

綜上所述,紙層析法和薄層層析法成本低,適合部分對精確度要求不高的含量測定。高效液相PITC柱前衍生法測定精確,成本較高,速度快,適合精確測定。然而,目前市場上仍缺乏一種快速又十分精確且價格低廉的L-蘇氨酸檢測方法,是本研究領域需要繼續解決的課題。