高效毛細管電泳法測定羊肚菌(Morchella sextelata)菌絲中單核苷類化合物含量的研究

馬曉穎,呂立濤,曹 君,李 躍,王 紅

(遼寧省農業科學院食用菌研究所,遼寧省食用菌優質栽培重點實驗室,遼寧沈陽 110161)

羊肚菌(Morchella)是一種子囊菌,它味道鮮美,香味獨特,營養豐富,保健功能全?，F代醫學研究表明,羊肚菌有“四抗”“兩降”“一調節”的藥用功效,即抗射線、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞作用,降血壓、降血脂和調節免疫力的功效[1]。它既是宴會上的珍品,又是醫藥中久負盛名的良藥[2],具有很大的研究價值。羊肚菌中有很多功能性物質,包括多糖、氨基酸和一些核苷類化合物[1]。核苷類成分具有降血脂、預防血栓及血管疾病、維持細胞生命、免疫調節、改善腦細胞代謝以及調節中樞神經等多種生理活性[3-4]。核苷類多被用于抗腫瘤抗病毒的藥物中,核苷類是治療肝炎及艾滋病等病毒性疾病的首選藥物[5]。

目前被發現的“長壽藥”煙酰胺單核苷酸(NMN)也是一種單核苷類化合物,有研究發現,NMN能夠顯著改善小鼠的生理機能的衰退,可以增強能量代謝,改善胰島素敏感性和血漿中脂質的分布情況,并且改善眼部功能[6]。在食用菌中,已經報道的含有單核苷類化合物的有蟲草[7]、猴頭菇、香菇[8]等,研究發現羊肚菌的主要成分有多糖、氨基酸、脂肪酸和一些無機元素和色素等[9],單核苷類化合物研究較少,核苷類化合物檢測方法有很多種,目前一般采用高效液相色譜的方法進行測定[10-12],高效液相可以不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制,并且應用范圍較廣;但是樣品分析時間長、色譜柱易污染、分析運營成本高;毛細管電泳法的特點是樣品預處理簡單,同時可測定多個成分的含量,較高效液相法簡便、快速;薄層色譜掃描法和紫外可見分光光度法的特點是儀器設備要求低,操作簡便,但方法的靈敏度和重現性差[13]。且未見有關于高效毛細管電泳測定羊肚菌單核苷類化合物含量的報道。

本文以羊肚菌Morchellasextelata菌絲提取物為測定目標,利用高效毛細管-二極管陣列檢測器來測定其中的單核苷化合物(3-脫氧腺苷,腺苷,鳥苷,尿苷,肌苷)的種類和含量,該方法簡單可靠,重復性好,不僅可用于羊肚菌中單核苷類化合物含量的測定,對其他樣品中的單核苷化合物的定性,定量檢測都有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌(Morchellasextelata) 來源于遼寧省農科院食用菌研究所;野生羊肚菌Mes-6、Mes-9 采集于遼寧省沈陽市康平縣;梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)和七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata) 購于四川農科院;硼砂Na2B4O7、硼酸H3BO3、磷酸氫二鈉Na2HPO4、磷酸二氫鈉NaH2PO4色譜純,美國Amresco生物試劑公司;單核苷化合物標準品、十二烷基磺酸鈉 色譜純,北京索萊寶科技有限公司;β-環糊精 分析純,上海源葉生物科技有限公司;甲醇 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;試驗用水 為超純水;馬鈴薯液體培養基:將200 g馬鈴薯去皮切碎,煮爛后取得土豆汁,加入20 g葡萄糖或者蔗糖,加入瓊脂15～20 g,加水至1000 mL,121 ℃滅菌即可。

P/ACE MDQ毛細管電泳儀 美國貝克曼公司;PHS-3C精密pH計 上海雷磁科技發展有限責任公司;ME204E電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HQ5200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;HZQ-QX全溫振蕩器 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;GRX6熱空氣消毒箱 上海精宏實驗設備有限公司;T25勻漿機 德國IKA集團;CascadaTM實驗室超純水系統 Pall corporation;微孔濾膜 水系和有機系孔徑0.22 μm,津隆設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品的配制 用精密天平分別稱取3-脫氧腺苷、腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷適量,用50%甲醇溶解并定容配制成1.0 mg/mL的標準液,上述溶液均用0.22 μm孔徑的有機濾膜濾過,超聲除氣,置冰箱4 ℃避光保存。

1.2.2 羊肚菌菌絲提取物的提取方法確定 將羊肚菌Morchellasextelata菌種活化以1∶200比例接種于馬鈴薯液體培養基中,25 ℃,180 r/min搖床培養7 d。將發酵液過濾后,菌絲體用無菌水沖洗3次,放入空氣消毒箱里60 ℃烘干得干菌絲體,稱取1 g放入50 mL離心管中,加入30 mL超純水,用勻漿機打勻;然后利用以下三種方式進行提取:a超聲提取30 min;在水浴鍋中95 ℃加熱保溫提取2 h;b選取單獨超聲30 min;c單獨水浴鍋95 ℃加熱保溫提取2 h;三種方法進行樣品的提取,通過比對不同提取方式下羊肚菌菌絲的指紋圖譜來確定實驗提取方法。

1.2.3 電泳條件的確定 高效毛細管電泳DAD二極管檢測器檢測，檢測器工作環境要干燥,環境濕度不大于80%,溫度變化小,且檢測過程中儀器不要搖動,接通電泳后儀器要預熱30 min后使用。

1.2.3.1 紫外檢測波長 利用毛細管電泳DAD二極管檢測器對5種單核苷類化合物(3-脫氧腺苷、腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷)進行190～300 nm波長下吸收值的測定,選擇最佳的試驗波長。

1.2.3.2 運行電壓的確定 本試驗考察15、18、20、25、30 kV作為運行分離電壓對分離5種單核苷類化合物的影響,波長為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗波長,運行緩沖液為pH9.0的25 mmol/L硼砂緩沖液,壓力0.5 Psi進樣10 s,運行時間為60 min。

1.2.3.3 緩沖液pH的確定 本試驗考察pH9.0、9.2、9.4和9.6的硼砂緩沖液為運行緩沖液pH對分離5種單核苷類化合物的影響,波長為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗波長,運行緩沖液其他條件為25 mmol/L硼砂緩沖液,運行電壓為20 kV,壓力0.5 Psi進樣10 s,運行時間為60 min。

1.2.3.4 緩沖液濃度的確定 實驗考察10、20、30、50 mmol/L的硼砂緩沖液對分離5種單核苷類化合物的影響,波長為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗波長運行緩沖液其他條件為pH9.0硼砂緩沖液,運行電壓為20 kV,壓力0.5 Psi進樣10 s,運行時間為60 min。

1.2.3.5 活性添加劑的確定 分別考察0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL濃度的β-環糊精對分離5種單核苷類化合物的影響,將β-環糊精加入到緩沖液中(樣品中稀釋一倍的緩沖液同樣添加),波長為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗波長,運行緩沖液為pH9.0的25 mmol/L硼砂緩沖液,運行電壓為20 kV,壓力0.5Psi進樣10s,運行時間為60 min。

1.2.3.6 進樣時間的確定 試驗分別考察5、8、10、15 s進樣時間對分離5種單核苷類化合物的影響,波長為1.2.3.1中篩選出的最佳試驗波長,運行緩沖液為pH9.0的25 mmol/L硼砂緩沖液,運行電壓為20 kV,運行時間為60 min。

1.2.4 方法精密度、穩定性 取標準品溶液配制成0.05 mg/mL連續進樣測定3次,記錄遷移時間和峰面積,計算出峰時間和峰面積的RSD值，確定方法的精密度;分別取50 μL的5種標準品1.0 mg/mL混合到一起,在室溫下放置0、2、4、6、8 h后,在最佳電泳條件下分別進樣,每次3個重復,計算遷移時間和面積的RSD值確定方法的穩定性。

1.2.5 羊肚菌(Morchellasextelata)樣品的測定 高效毛細管電泳對羊肚菌(Morchellasextelata)中單核苷類化合物的測定采用內標法(5種標準品混合物),將5種標準品(1 mg/mL)各吸取40 μL配制成混合標樣,再分別加入等比例的處理好的羊肚菌菌絲提取物中,剩下的用緩沖液定容到200 μL,將混合標樣、羊肚菌菌絲提取物以及羊肚菌菌絲提取物加混標分別進樣,每一種樣品進樣3次。按優化得出的最優電泳條件進行測定。

1.2.6 羊肚菌其他菌種中單核苷化合物的測定 本試驗所選擇的羊肚菌菌種為六妹羊肚菌(Morchellasextelata),是目前較為常用的人工栽培羊肚菌的菌種,抗雜能力強,產量高,菌種穩定性好。實驗也收集了一些其他羊肚菌品種,有一部分是野生的,一部分是人工可栽培的。野生羊肚菌Mes-6、Mes-9、梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)和七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)菌絲按照最優提取方法處理,對它們進行處理后,用最優電泳條件進行樣品的分離,測定它們的單核苷含量。

1.3 數據處理

采用Excel軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌菌絲樣品提取方法的確定

在本實驗中對羊肚菌菌絲提取方法進行了優化,采用60 ℃烘干得干菌絲體,稱取1 g放入50 mL離心管中,加入30 mL超純水,用勻漿機打勻,然后利用三種方法進行樣品的提取,通過比對不同提取方式下羊肚菌菌絲的指紋圖譜來確定實驗提取方法。結果如圖1所示,單獨超聲和單獨水浴的提取方法使得毛細管電泳的指紋圖譜不完整,可能是由于提取不徹底導致,所以選擇先超聲后水浴的方法為最后的提取方法。

圖1 不同提取方法對羊肚菌指紋圖譜的影響 Fig.1 Effects of different extraction methodson the fingerprint of Morchella注:a超聲提取30 min,在水浴鍋中95 ℃加熱保溫2 h;b選取單獨超聲30 min;c單獨水浴鍋95 ℃加熱保溫2 h。

2.2 紫外檢測波長的確定

通過實驗測得:3-脫氧腺苷190～219 nm吸收值最高;腺苷是190～223 nm和247～275 nm;鳥苷是190～228 nm和237～285 nm;尿苷是190～218 nm;肌苷是190～214 nm。且3-脫氧腺苷在190～212 nm間有一個干擾峰,所以選擇214 nm為試驗的運行波長(圖2)。

圖2 5種標準品214 nm下的吸收圖譜Fig.2 Absorption spectra of five standards at 214 nm注:A:3-脫氧腺苷;B:腺苷;C:鳥苷;D:尿苷;E:肌苷；圖3～圖5，圖8同。

2.3 運行電壓對樣品分離效果的影響

在毛細管電泳中,分離電壓對樣品的分離度和遷移時間有很大的影響。要盡可能選用比較高的電壓,以達到樣品分離的最佳狀態,但是電壓越高各個物質的距離越近,這樣遷移時間比較近的物質就容易分不開,所以根據分離的物質不同,選取的分離電壓需要優化,以達到最佳的分離效果。圖3表明:隨著電壓的增高,5種單核苷類的遷移時間都向前移動,分離的順序為3-脫氧腺苷、腺苷、鳥苷、尿苷和肌苷。其中15 kV和18 kV分離時間過長,20 kV以上均可達到20 min內分離5種單核苷化合物的目的,但是30 kV鳥苷和尿苷的分離度過低,所以選擇25 kV為本試驗的分離電壓。

圖3 不同分離電壓對5種單核苷化合物分離的影響Fig.3 The effect of different separation voltageson the separation of five mononucleosides

2.4 緩沖液pH對樣品分離的影響

緩沖液的酸堿性對物質的分離有很大的影響,經過緩沖液pH的優化,即使有相近等電點的物質也可以得到分離[14]。圖4表明,pH越大,5種標準品分得越開,在pH9.0時鳥苷和尿苷和腺苷都未得到很好的分離,pH9.2時鳥苷和尿苷也未得到分離,pH9.4和pH9.6時5種標準品的分離度較好,但是pH9.6時5種物質的分離總時間大于20 min。所以選擇pH9.4為試驗緩沖液pH。

圖4 不同緩沖液pH對5種單核苷化合物分離的影響Fig.4 The effect of pH in different buffers on theseparation of five kinds of mononucleoside compounds

2.5 緩沖液濃度對樣品分離的影響

緩沖液濃度會影響溶液的黏度,高濃度的硼酸鹽會增大樣品的分離度,但濃度過大,電流過大,焦耳熱效應增加會使得樣品中各個物質的峰變寬,延長時間變長,從而降低了樣品的分離效率[15-16]。圖5表明,10、20 mmol/L硼砂緩沖液作為分離運行緩沖液時腺苷、鳥苷和尿苷沒有分來,除腺苷外,鳥苷和尿苷系統均未顯示遷移時間,30 mmol/L硼砂緩沖液鳥苷和尿苷的分離度沒有50 mmol/L的硼砂緩沖液高,因此選擇50 mmol/L為運行緩沖液濃度。

圖5 不同緩沖液濃度對5種單核苷化合物分離的影響Fig.5 The effects of different buffer concentrationson the separation of five mononucleoside compounds

2.6 β-環糊精添加量對樣品分離的影響

為了不同的分離分析目的,經常需要在緩沖溶液中加入不同的添加劑,表面活性劑可起到改變電滲流,溶解疏水性溶質等作用[17]。圖6表明,在添加的4種不同濃度的β-環糊精的緩沖液中,5種單核苷類化合物不同濃度的β-環糊精添加到緩沖液中后標準品的電泳圖譜的遷移時間沒有顯著性差異(P>0.05),但是在分離羊肚菌菌絲體提取物樣品中,添加1.0 mg/mLβ-環糊精的樣品分離效果好于其他濃度,所以選取1.0 mg/mLβ-環糊精作為試驗添加劑(見圖7)。

圖6 β-環糊精添加量對5種單核苷類化合物分離的影響Fig.6 The effect of β-cyclodextrin additionon the separation of 5 mononucleoside compounds

圖7 緩沖液添加 1.0 mg/mL β-環糊精的羊肚菌菌絲指紋圖譜(a)和未添加β-環糊精的羊肚菌菌絲指紋圖譜(b)Fig.7 Hypha fingerprint of Morchella with 1.0 mg/mLβ-cyclodextrin in buffer solution(a)and hypha fingerprint ofMorchella without β-cyclodextrin in buffer solution(b)

2.7 進樣時間對樣品分離的影響

在毛細管電泳對物質分離的過程中,物質的濃度對樣品的分離和峰型有很大的影響,而樣品的進樣濃度與處理方法,所選溶劑的溶解度和進樣時間都有關系,所以在樣品分離時,對進樣時間進行優化可以減少在其他方面的工作量[18-19]。圖8表明,不同的進樣時間對5種標準品的分離時間沒有較明顯的影響,但是隨著進樣時間增大,5種單核苷化合物的峰寬均變寬(見圖9),影響分離效率。而當進樣時間為5 s時,鳥苷和尿苷沒有完全分離,所以選擇8 s為試驗進樣時間。

圖8 不同進樣時間對5種單核苷化合物分離的影響 Fig.8 Effect of different injection timeon the separation of five mononucleosides

圖9 不同進樣時間對5種標準品峰寬的影響Fig.9 Effect of different injection timeon peak width of five standard products

2.8 方法的精密度的測定

操作方法參照[20-21],取標準品溶液配制成0.05 mg/mL連續進樣測定3次,記錄遷移時間和峰面積,計算3-脫氧腺苷遷移時間RSD為0.167%,峰面積的RSD為2.78%;腺苷遷移時間RSD為0.083%,峰面積的RSD為1.40%;鳥苷遷移時間RSD為0.61%,峰面積的RSD為2.9%;尿苷遷移時間RSD為0.66%,峰面積的RSD為2.72%;肌苷遷移時間RSD為0.89%,峰面積的RSD為1.96%。5種標準品的遷移時間RSD均小于0.89%,峰面積RSD均小于2.9%。

2.9 方法穩定性的測定

操作方法參照[22-23],分別取50 μL的5種標準品1.0 mg/mL混合到一起,在室溫下放置0、2、4、6、8 h后,在最佳電泳條件下分別進樣,每次3個重復,計算3-脫氧腺苷遷移時間RSD為0.5%,峰面積的RSD為3.84%;腺苷遷移時間RSD為0.53%,峰面積的RSD為2.62%;鳥苷遷移時間RSD為0.51%,峰面積的RSD為2.87%;尿苷遷移時間RSD為0.56%,峰面積的RSD為4.06%;肌苷遷移時間RSD為0.61%,峰面積的RSD為4.73%。表明方法的精密性較好。5種標準品的遷移時間RSD均小于0.61%,峰面積RSD均小于4.73%。表明標準品在8 h內具有良好的穩定性。

2.10 羊肚菌Morchella sextelata中核苷類化合物的測定

2.10.1 定性分析 操作方法參照文獻[24-25],圖10結果表明,3-脫氧腺苷、腺苷和尿苷出峰時間能與羊肚菌菌絲提取物中的幾個單峰出峰時間相一致。再進一步確定將這3種標準品混合后加入樣品中,如圖11所示,加入混合標樣后的樣品色譜峰的個數沒有增加,有相應的幾個峰的峰面積明顯加大,進一步確定了羊肚菌菌絲中含有3-脫氧腺苷、腺苷和尿苷。

圖10 羊肚菌菌絲體提取物色譜圖(a)和5種單核苷類化合物(b)Fig.10 The chromatogram of mycelium extractfrom Morchella chinensis(a)and fivekinds of mononucleoside compounds(b)

圖11 羊肚菌菌絲體提取物(a)和羊肚菌菌絲體提取物加3-脫氧腺苷、腺苷和尿苷(b)Fig.11 Morchella mycelium extract(a)and Morchella myceliumextract plus 3-deoxyadenosine,adenosine,uridine(b)

2.10.2 定量測定

2.10.2.1 標準曲線的建立 將3種單核苷類化合物(3-脫氧腺苷、腺苷、尿苷)用50%甲醇配成1 mg/mL的母液,根據毛細管電泳中的定量計算方法,將3種單核苷類化合物標準品用緩沖液配成不同濃度分別進行進樣測定。記錄峰面積積分值,以對照品濃度(mg/mL)為橫坐標,以對照品峰面積為縱坐標,進行線性回歸方程的建立[26]。結果表明(見表1):決定系數R2的范圍為0.9992～0.9997。

2.10.2.2 實際樣品的定量測定 利用3種單核苷類化合物的標準曲線,將樣品中3-脫氧腺苷、腺苷、尿苷的峰面積分別帶入方程,并乘以提取液體的體積得到羊肚菌中3-脫氧腺苷含量為4.38 mg/g、腺苷含量為6.6 mg/g、尿苷含量為7.8 mg/g。

表1 羊肚菌中核苷類化合物的含量Table 1 Contents of nucleosides in Morchella

表2 樣品加標回收率試驗(n=3)Table 2 The recovery test of sample added standard(n=3)

2.11 回收率的測定

在羊肚菌菌絲體中測得的3種單核苷化合物濃度基礎上添加低、中、高濃度的標準品,按照最佳優化條件進樣測定,每一個樣品進樣3次[27]。將測得的峰面積帶入到標準方程中,得出的濃度再除以理論濃度,得到回收率。表2表明,3種單核苷類化合物的回收率在95.5%～100.8%之間,且RSD小于4.9%。表明該方法適用于羊肚菌菌絲中3種單核苷類化合物的測定。

2.12 羊肚菌其他菌種中單核苷化合物的測定

結果如圖12所示,3-脫氧腺苷中六妹含量最高,Mes-6含量最低;腺苷是Mes-6含量最高,梯棱羊肚菌含量最低;尿苷是Mes-6含量最高,梯棱羊肚菌含量最低。Mes-6菌絲體中腺苷含量是梯棱羊肚菌的4.92倍,尿苷含量是梯棱羊肚菌的5.92倍。

圖12 不同品種的羊肚菌菌絲中單核苷類化合物的測定Fig.12 Determination of mononucleoside compoundsin hyphae of different species of Morchella

3 結論

利用二極管陣列檢測器建立了5種單核苷類化合物的高效毛細管電泳圖譜,對樣品提取方法和電泳條件進行了優化,最終確定了以用菌粉按照1∶30加水先超聲后水浴的方法提取樣品的提取方法,以及最佳電泳條件為pH為9.4的50 mmol/L硼砂緩沖液以及1.0 mg/mL的β-環糊精為運行緩沖液,分離電壓為25 kV,進樣時間為8 s。再以羊肚菌菌絲提取物為樣品進行5種單核苷類化合物的測定,結果表明羊肚菌Morchellasextelata菌絲中含有3-脫氧腺苷、腺苷以及尿苷。并與其他不同種類的羊肚菌菌絲提取物進行單核苷類化合物的含量的比對。野生羊肚菌Mes-6和Mes-9采集于遼寧省,為黃色系品種,目前人工栽培仍然不穩定。3-脫氧腺苷參與人體的免疫調節作用,可增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷力[28]。而腺苷可在凝血和炎癥反應的調節中發揮介導的作用[29]。尿苷是藥物合成的中間體,阻斷癌細胞合成,修復受損基因等作用[30]。雖然野生羊肚菌Mes-6人工栽培不穩定,但是利用其菌絲體中的活性成分,將它應用到制藥行業,也可成為羊肚菌發展的一條新途徑。

目前測定單核苷類化合物通常用高效液相的方法[31],但是液相的流動相會用到大量的有機溶劑,樣品的需求量也較高。高效毛細管電泳分離模式中溶質基于各自電泳遷移速率的不同而進行分離,組分在電泳中的流出順序與組分的質荷比有關,不同質荷比的組分具有不同的遷移速度,因而物質得到分離。所有液相色譜的分離模式,包括正相、反相、離子交換、親和、篩分等都可以在毛細管電泳中找到相應的模式[32]。本文利用對毛細管電泳中5種單核苷類物質分離需要的不同參數進行優化,得到分離效果較好的方法,除了本文涉及的羊肚菌菌絲體內的相關物質的測定,還可以應用到其他的樣品的測定中去。并且高效毛細管電泳還具有分離效率高、分析速度快、樣品和試劑用量少等特點,是一種更為環保、無害、便捷的檢測方法,可以廣泛的應用在各種領域中去。