貯藏溫度對方格星蟲與革囊星蟲質構、內源酶與水分變化的影響

盧 鑫,白云霞,龐一揚,江虹銳,劉小玲

(廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530000)

方格星蟲(Sipunculuslnnaeus,1766)又名沙腸子、沙蟲等,為方格星蟲科(Sipunculidae rafinesque,1814)[1];革囊星蟲(Phascolosomaleuckart,1828)又名海泥蟲、泥丁等,為革囊星蟲科(Phascolosomatidae stephen et edmonds,1972)[2]。兩種星蟲均無節,呈蠕蟲狀,屬海產體腔動物,在我國沿海從南到北均有分布,其中以廣西海區資源較豐富[1]。星蟲味道鮮美、營養豐富,藥用價值較高,故有“海洋蟲草”的美譽,是一種高值海珍品,具有重要經濟價值[3]。目前研究學者針對星蟲的研究主要集中在物種分類、基因研究、人工養殖、營養分析、功能活性[4-6]、加工風味[7-8]與組織結構[9-11]等方面,關于其不同溫度貯藏期間的質構品質變化未見報道。

星蟲具有獨特的質構特征,表現為質地優良,口感脆嫩,深受廣大消費者的青睞,而貯藏過程對星蟲的質構品質會產生顯著影響。水分、內源蛋白酶活、組織結構變化是影響水產品品質優劣的重要因素[12-13]。Zhang等人研究發現鰱魚質構與肌原纖維極顯著相關[14]。而內源蛋白酶及水分的變化將直接影響纖維結構[15-16]。

本實驗主要比較了不同貯藏溫度對方格星蟲與革囊星蟲質構、纖維結構、內源蛋白酶活及水分特性變化的影響,綜合反映其質構品質變化規律,為后期更好實現星蟲?；畋ｕr提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

方格星蟲(SN)、革囊星蟲(PE) 廣西南寧安吉海鮮市場采購;Tris-HCl 北京索萊寶科技有限公司;酪蛋白 北京索萊寶科技有限公司;三氯乙酸(TCA) 成都市科隆化學品有限公司;以上試劑均為分析純。

TA.XT plus型物性測定儀 英國Stable Micro systems公司;F16502型掃描電鏡 荷蘭PHENOM公司;Himac CR21N型高速冷凍離心機 日本日立公司;Lab Master-aw型水分活度儀 瑞士Novasina公司;SQP型電子天平 德國Sartorius公司;MR20-025V-1型核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 星蟲樣品的貯藏實驗 將市場上采購的鮮活方格星蟲(體長13±1 cm,體寬1.0±0.2 cm,體質量15±2 g)、革囊星蟲(體長15±5 cm,體寬1.0±0.2 cm,體質量10±2 g)置于人工氣候培養箱中貯藏,光照強度控制在20%,濕度控制在60%;通過預實驗觀察兩種星蟲分別在4 ℃貯藏48 h,30 ℃貯藏22 h后開始出現死亡現象;因此選擇分別于4 ℃下貯藏0、4、8、16、24、36、48 h,30 ℃下貯藏0、2、4、6、10、14、22 h后,隨機抽取3～5條,除去內臟等不可食部分,對其質構特征、組織結構、內源蛋白酶活、水分分布、水分含量、水分活度進行測定。

1.2.2 質構特征測定 采用BSK剪切探頭測定兩種星蟲剪切力、咀嚼性,剪切測試程序的主要參數為:選用HDP/BS探頭,測試前速度:1 mm/s測試速度:5 mm/s測試后速度:10 mm/s剪切距離:50 mm觸發力:5.0 g;;采用P/2N穿刺探頭測定兩種星蟲硬度、韌性,穿刺測試程序的主要參數為:選用P/2N(針形)探頭,測試前速度:1 mm/s;測試速度:1 mm/s;測試后速度:1 mm/s;穿刺距離:10 mm;觸發力:5.0 g。

1.2.3 組織結構掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 參考肖桂華[12]的SEM樣品處理及觀察方法,將在4和30 ℃貯藏不同時間的兩種星蟲除去內臟等不可食部分清洗并瀝干表面水分后置于-80 ℃預凍12 h后,冷凍干燥48 h(冷阱溫度-50 ℃,真空度10 Pa隔熱板溫度30 ℃),對凍干后的樣品切成1.0 cm×0.5 cm方形組織塊,對其橫切面采用離子濺射噴金,SEM放大1000倍對兩種星蟲肌肉組織環肌層(CML)進行觀察。

1.2.4 內源蛋白酶活的測定 將不同時間貯藏后的整條星蟲勻漿后稱取5.00 g,在4 ℃的條件下,按料液比1∶4 (m:v),加入20 mL pH8.0的Tris-HCl,4 ℃下浸泡6 h,4 ℃下1000 r/min離心10 min,取上清液即為粗酶液。取兩支試管為1和2,各加入4.00 mL的Tris-HCl緩沖液和1.60 mL的1%酪蛋白后,往1加入4.00 mL的10% TCA,振蕩搖勻1 min,兩支試管放入35 ℃水浴保溫5 min,往兩支試管各加入0.80 mL的粗酶液,搖勻振蕩,1 min,35 ℃水浴反應15 min,2中加入2.40 mL的10% TCA,搖勻振蕩1 min,將兩支試管中樣品10000 r/min離心15 min,取上清液,以1為空白組,2為反應組,于275 nm波長下測定吸光值[17]。

單位酶活力(U)定義[18]為:在275 nm波長下,單位質量樣品在單位時間內水解酪蛋白底物而增加0.001吸光度值所需的酶量為1個酶活力單位。

酶活力(U/g)=ΔOD/[15 min×0.001×(0.8 mL÷20 mL)×5 g]

式中:ΔOD為實驗組與空白組吸光值變化量;15 min為反應時間;0.8 mL為所取粗酶液體積,20 mL為總粗酶液體積,5 g為樣品質量。

1.2.5 水分特性的測定

1.2.5.1 水分分布的測定 使用核磁共振成像分析儀,參考鞏濤碩等[19]和宋朝鵬等[20]的方法,將星蟲樣品切成長寬為2 cm×1 cm肉塊,擦干樣品表面水分,稱量重量在0.80±0.02 g,保鮮膜包裹后置于低場核磁共振(LF-NMR)分析儀中。CPMG序列參數:回波個數NECH=15000,回波時間TE=0.6 ms,累加采樣次數NS=4,每個樣品重復三次。

1.2.5.2 水分含量的測定 參照《GB 5009.3-2016 食品安全國家標準 食品中水分的測定》,采用直接干燥法測定方格星蟲與革囊星蟲在不同貯藏階段的水分含量[21]。

1.2.5.3 水分活度的測定 使用水分活度測定儀測定(溫度設置為25 ℃)。

1.3 數據處理

每組試驗三個平行,用Excel 2016對數據進行處理,采用SPSS 20.0 Duncan法進行顯著性差異分析(P<0.05表示差異顯著),使用Origin 9.1進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度貯藏過程中星蟲質構特性的變化

因樣品厚度僅1～2 mm,不適用壓縮模式進行質構測定,故選用穿刺與剪切模式測定星蟲質構特征:硬度、韌性、剪切力、咀嚼性。兩種星蟲在4及30 ℃貯藏過程中質構的變化分別如圖1(A)～(D)、(E)～(G)所示。SN在4 ℃下貯藏0～48 h,硬度、韌性、剪切力、咀嚼性呈下降趨勢,在16～24 h顯著下降(P<0.05),故4 ℃貯藏時間應控制在0～16 h,貯藏16 h其硬度、咀嚼性分別下降19.08%、33.94%。在30 ℃貯藏0～22 h,除韌性上升其他呈下降趨勢,且硬度、剪切力、咀嚼性在10～14 h變化顯著(P<0.05),因此30 ℃貯藏應控制在10 h內,其硬度、咀嚼性分別下降41.61%、41.39%。

圖1 方格星蟲與革囊星蟲在4、30 ℃藏期間的質構變化Fig.1 Changes of SN and PE’ texture during 4 and 30 ℃ storage注:同折線上不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),圖3～圖6同;圖(A)～(D)為4 ℃貯藏,(E)～(H)為30 ℃貯藏。

PE在4 ℃貯藏0～48 h,其硬度與韌性變化趨勢與SN一致,剪切力與咀嚼性先下降后上升,在0～16 h內硬度和咀嚼性分別下降16.06%、12.62%;在30 ℃貯藏0～22 h,其質構變化趨勢同樣與SN一致,在10～14 h質構變化顯著(P<0.05),其硬度、咀嚼性分別下降25.02%、17.68%。

上述結果表明,星蟲貯藏過程中質構除韌性外均下降,4 ℃低溫貯藏相比30 ℃貯藏能夠保持星蟲質構時間更長。馮丁丁[22]研究海參在4、20 ℃條件下質構變化,結果顯示在20 ℃條件下1/4 d硬度與咀嚼性明顯下降,在4 ℃下15～25 d硬度和咀嚼性急劇下降,因原料及樣品處理差異導致貯藏時間不一,但表明4 ℃低溫貯藏能有效減緩質構的變化,與本文研究結果一致。

2.2 不同溫度貯藏過程中星蟲微觀結構的變化

質構與肌原纖維蛋白極顯著相關[14],星蟲組織結構以肌肉組織為主,肌肉組織主要由肌原纖維構成,因此對貯藏過程中星蟲肌原纖維結構變化進行觀察。SN在4及30 ℃貯藏過程中不同時間點肌肉組織變化如圖2(A)、(B)所示,在4 ℃貯藏0～16 h,環肌層(CML)肌原纖維由排列整齊的直線狀,逐漸出現彎曲現象且纖維間空隙增大;在貯藏16 h后如圖中標記處可以看出,由于肌肉組織皺縮嚴重,纖維排列更加密集,與0 h處肌肉纖維差異明顯,故4 ℃貯藏SN應控制在16 h內，其肌肉纖維變化相對較小。在30 ℃貯藏,CML肌原纖維隨貯藏時間增長,逐漸皺縮變細,纖維間空隙變大,在前10 h變化不明顯,14、22 h變化較大,纖維皺縮嚴重,間隙明顯增大,故30 ℃貯藏SN應控制在10 h內,其肌肉纖維變化相對較小。

PE在不同溫度下貯藏其肌肉組織變化如圖2(C)、(D)所示,在4 ℃貯藏0～16 h,PE纖維變粗,逐漸出現雜亂,16 h后開始出現皺縮斷裂,24 h處變化明顯;在30 ℃貯藏肌肉纖維隨貯藏時間增長,纖維寬度變細,纖維排布由疏松變緊密,纖維間空隙變小,貯藏14 h纖維與0 h相比出現明顯變化。故PE在4 ℃及30 ℃貯藏應分別控制在16、14 h內。

圖2 星蟲在4、30 ℃貯藏期間的肌肉組織變化Fig.2 Change of SN and PE’s muscle tissue during 4 and 30 ℃ storage

上述結果表明,星蟲在貯藏過程中纖維結構會發生明顯變化,且4 ℃比30 ℃貯藏纖維變化程度更緩慢。魚肉組織中與星蟲組織同樣存在大量肌原纖維,沈妮[23]研究帶魚在0與4 ℃下貯藏組織結構的變化,發現隨貯藏時間延長,肌纖維間隙增大,紊亂松散,甚至出現斷裂,且溫度越低越能夠有效抑制帶魚肉蛋白的變性降解,越有利于維持帶魚肉肌纖維的完整性。其研究結果中肌原纖維變化規律與本研究相似,且4 ℃相比于30 ℃溫度更低,其中4 ℃低溫貯藏星蟲纖維更完整,變化程度更小,兩者結果相一致。

2.3 不同溫度貯藏過程中星蟲內源蛋白酶活的變化

圖3 星蟲在4、30 ℃貯藏過程中星蟲內源蛋白酶活性的變化Fig.3 Change of PE and SN’ endogenous protease activity during 4 and 30 ℃ storage

內源蛋白酶直接影響蛋白變化,蛋白變化對纖維組織結構影響較大,進而引起質構劣變[23],因此對貯藏過程中星蟲內源蛋白酶活變化進行觀測。星蟲在4與30 ℃貯藏過程中單位質量內源蛋白酶活的變化如圖3(A)、(B)所示。SN于4 ℃貯藏在0～16 h單位質量內源蛋白酶活由48.0 U/g上升至102.6 U/g,16 h后酶活顯著下降(P<0.05),最終在48 h降至31.8 U/g;SN在30 ℃貯藏隨時間增長,酶活呈下降趨勢,0、10、22 h SN內源蛋白酶活分別為54.4、18.3、5.8 U/g,10 h后酶活顯著下降(P<0.05)。

PE在4 ℃貯藏在0～16 h酶活由57.1 U/g升至95.7 U/g,16 h后酶活顯著下降(P<0.05),最終在48 h下降至26.8 U/g。星蟲在4 ℃貯藏單位質量內源蛋白酶呈先上升后下降的趨勢,與王博[24]研究中國蛤蜊、菲律賓蛤仔、三疣梭子蟹、鋸緣青蟹、蝦夷扇貝在0～4 ℃貯藏內源蛋白酶活整體呈先上升后下降的趨勢一致。星蟲在4 ℃貯藏16 h及30 ℃貯藏0～22 h隨時間增長酶活下降,可能由于細胞逐漸凋亡瓦解導致酶活降低[25]。

圖4 星蟲在4、30 ℃貯藏過程中不同水分占比的變化Fig.4 Changes of different water percent of SN and PE during 4 and 30 ℃ storage

2.4 不同溫度貯藏過程中星蟲水分特性的變化

2.4.1 水分分布的變化 水分的分布變化直接影響纖維結構,進而對質構產生影響[15-16]。星蟲在4、30 ℃貯藏過程中不同水分變化如圖4所示,根據弛豫時間可以將水分分為:T21(1～10 ms)為結合水,T22(10～100) ms為不易流動水,T23(100～1000) ms為自由水[26],結果顯示星蟲中T22占比最高。SN在4 ℃貯藏過程中,T21水分占比在0～16 h變化不顯著(P>0.05),T22水分占比呈上升趨勢,在0～16 h占比上升13.42%,16 h與0 h相比顯著上升(P<0.05),T23水分占比呈下降趨勢,在16 h下降達12.11%,與0 h相比顯著下降(P<0.05);SN在30 ℃貯藏過程中,T21水分占比在0～10 h變化不顯著(P>0.05),因為它具有0.1～1 ms的短弛豫時間,并且這些分子與大分子和蛋白質緊密相關,因此波動不大[27]。T22水分占比呈上升趨勢,在10 h占比最高,且上升16.19%,與0 h相比顯著上升(P<0.05),T23水分占比呈下降趨勢,在10 h占比最低,下降達14.18%,與0 h相比顯著下降(P<0.05)。

圖5 星蟲在4、30 ℃貯藏過程中水分含量的變化Fig.5 Change of water content of SN and PE during 4 and 30 ℃ storage

圖6 星蟲在4、30 ℃貯藏過程中水分活度的變化Fig.6 Change of water activity of SN and PE during 4 and 30 ℃ storage

PE貯藏過程中水分分布變化與SN基本一致。不同溫度貯藏星蟲T21結合水占比變化不顯著(P>0.05),在4 ℃貯藏T22不易流動水占比上升率高于30 ℃,T23自由水占比下降率低于30 ℃,可能由于貯藏溫度越高導致自由水流失量大。崔宏博等[28]研究南美白對蝦在貯藏過程中水分分布的變化時發現,T22不易流動水占比下降,T23自由水占比上升,與星蟲水分變化相反,可能由于兩種樣品處理方式及樣品內部結構差異導致。

2.4.2 水分含量的變化 兩種星蟲蟲體水分含量超80%[29],在貯藏過程中對其含量變化的觀測具有必要性。在4 ℃貯藏,隨時間增長星蟲水分含量變化如圖5(A)所示,SN水分含量高于PE,變化不顯著(P>0.05),整體呈先上升后下降的趨勢,SN在貯藏8 h水分含量最大,達84.82%;PE在貯藏16 h水分含量達到最大值77.46%。

在30 ℃貯藏下,兩種星蟲水分含量的變化如圖5(B)所示,整體呈下降趨勢,在0～10 h下降不顯著(P>0.05);SN前10 h含水量由83.34%下降至80.96%,22 h最終下降至74.05%,PE在相同時間點水分含量分別為75.81%、73.44%、59.10%。星蟲30 ℃貯藏10 h后水分含量顯著下降(P<0.05),與貯藏過程中水分蒸發損失有關[28]。30 ℃貯藏水分呈下降趨勢且變化比4 ℃貯藏更明顯,這是由于低溫貯藏能抑制某些微生物的生長活動,溫度升高貯藏時間延長微生物生長繁殖速率加快,對蛋白質等營養物質的分解加快,星蟲結合水的能力下降,導致水分含量下降[30]。

2.4.3 水分活度的變化 水分活度反映了水分子的存在狀態以及自由水與結合水的比例[31]。星蟲在4 ℃貯藏過程中不同時間點水分活度由圖6(A)可得,星蟲水分活度呈先下降后上升趨勢,兩種星蟲水分活度變化趨勢基本一致,在16 h處水分活度最低分別為0.95、0.96,在36 h后趨于穩定。說明在4 ℃貯藏16 h前星蟲中水分的結合程度呈上升趨勢,16 h以后隨著水分流失,水分的結合程度降低。

星蟲在30 ℃貯藏過程中不同時間點水分活度由圖6(B)可得,兩種星蟲水分活度整體呈先上升后下降的趨勢,兩種星蟲水分活度上升下降幅度較一致,SN水分活度在30 ℃貯藏6 h后開始下降,PE在10 h后出現下降。說明在30 ℃貯藏,星蟲水分的結合程度先下降后上升,由于不易流動水向自由水移動,且星蟲水分損失嚴重導致。

SN與PE水分活度大小相差較小,4 ℃貯藏與30 ℃貯藏過程兩種水分活度變化相反,可能由于在4 ℃貯藏中星蟲水分流失較小,水分結合度高,則水分活度先下降,隨著貯藏時間越長,16 h后水分流失,結合程度下降,則水分活度上升;在30 ℃貯藏中星蟲水分流失較大,水分結合度低,則水分活度先上升,隨著貯藏時間越長,SN達到6 h,PE達到10 h后水分基本不明顯流動,結合程度上升,則水分活度下降。

3 結論

星蟲在4 ℃下貯藏0～16 h相對30 ℃貯藏0～10 h,其質構特征下降程度較小,且纖維組織變化相對不明顯,內源蛋白酶活及水分特征變化相對緩慢;4 ℃貯藏16～24 h與30 ℃貯藏10～14 h各指標結果發生明顯變化。綜上所述低溫4 ℃貯藏星蟲能有效延緩其質構變化,表現為纖維組織、內源酶活和水分特征相應變化程度。因此在對方格星蟲革囊星蟲運輸貯藏過程中,4 ℃貯藏應控制在0～16 h,30 ℃貯藏應控制在0～10 h的時間范圍,從而降低貯藏對星蟲品質影響,此研究對星蟲貯藏過程中食用價值的保護具有重要意義。