莪術醇長循環脂質體的制備及體外抗乳腺癌作用研究

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(1.桂林醫學院藥學院,廣西桂林 541004;2.井岡山大學附屬醫院,江西吉安 343000)

莪術醇(curcumol,Cur)又名姜黃醇,屬于倍半萜類化合物,存在于姜科植物蓬莪術、廣西莪術或溫郁金的干燥根莖中,是莪術揮發油的主要抗腫瘤成分[1-2];分子式為C15H24O2,分子量為236.35;在有機溶劑中溶解度較大,易溶于乙醚、氯仿,溶于乙醇,幾乎不溶于水,在水中的溶解度僅為0.3%。莪術醇被證明在肝癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等多種人類癌癥中具有體內和體外抑制增殖及誘導凋亡效應[3-4]。

脂質體(Liposome,Lp)具有良好的生物相容性和腫瘤靶向性,是近年來研究較多的一種藥物載體,可以作為各類化療藥物的傳遞載體[5-6]。利用脂質體包裹莪術醇可提高其溶解度,增強其穩定性。但是,普通脂質體易從體內清除,聚乙二醇[Poly(ethylene glycol),PEG]修飾普通脂質體制備而得的長循環脂質體可躲避巨噬細胞對脂質體的識別和吞噬,延長脂質體在體內的循環時間,從而提高制劑在腫瘤部位的蓄積,達到更好的抗腫瘤效果[6-7]。Walkey等[8]報道稱隨著PEG修飾密度的升高,血清蛋白吸附量和巨噬細胞對制劑的攝取能力均顯著下降,證明兩者顯著相關。

本研究采用薄膜分散法制備莪術醇長循環脂質體,測定了其形態、粒徑、電位、包封率;考察其體外釋放和初步穩定性;并進一步考察了莪術醇長循環脂質體的細胞攝取及細胞毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莪術醇(98%,批號:CC070518) 上海滬云醫藥開發有限公司;二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000,批號:B03011) 上海芃碩生物有限公司;噻唑藍 MTT，美國Sigma公司;香豆素-6 批號:MKBV4602V，美國Alorich公司;DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素溶液 美國Gibco公司;膽固醇 上海行知化工廠;卵磷脂 德國Lipoid公司;透析袋,截留相對分子量8000-14000 上海生工生物工程技術服務公司;微孔濾膜(0.22 μm) 天津市津騰實驗設備有限公司,人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB231 桂林醫學院實驗中心贈予。

LC-20A高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司;EYEL4旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司;JY88-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;SHA-B恒溫震蕩器 常州國華電器有限公司;CP225D型電子天平 德國Sartorius公司;DF-101集熱式恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠;Nano ZS90激光散射粒度分析儀 英國Malvern公司;SynergyHTX多功能酶標儀 美國Bio Tek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 莪術醇含量測定方法的建立

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil BDS C18反相柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流速1.0 mL·min-1,檢測波長203 nm;柱溫:30 ℃;流動相:乙腈:0.2%醋酸水溶液(體積55∶45);進樣量:20 μL[9]。

1.2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱定莪術醇對照品于容量瓶中,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶,搖勻,得對照品儲備液。濃度分別為10、20、40、80、160 μg·mL-1,精密吸取20 μL進樣,以峰面積對質量濃度進行線性回歸[10]。

1.2.1.3 精密度試驗 精密稱取莪術醇對照品于容量瓶中,用甲醇溶解稀釋并定容至10 mL,濃度為40 μg·mL-1,搖勻,按“1.2.1.1”項下色譜條件,連續進樣測定5次,記錄莪術醇峰面積,計算日內精密度[10]。

1.2.1.4 穩定性考察 精密稱取莪術醇對照品于容量瓶中,適量甲醇溶解后,用甲醇稀釋并定容至10 mL,濃度為40 μg·mL-1,搖勻,于0、1、2、4、6、8 h,按“1.2.1.1”項下色譜條件,進樣分析,測定記錄莪術醇峰面積。

1.2.1.5 加樣回收率試驗 精密量取已知質量濃度的莪術醇脂質體樣品溶液9份,各0.5 mL,分別加入80%、100%、120%的莪術醇對照品,加甲醇溶解超聲10 min(200 W,30 ℃),0.22 μm微孔濾膜濾過,精密吸取20 μL,HPLC測定。將結果代入標準曲線計算質量濃度,與實際質量濃度相比,得到樣品回收率[9]。

1.2.2 莪術醇長循環脂質體的制備 采用薄膜分散法制備長循環脂質體[11-13],精確稱取處方量的莪術醇0.018 g,卵磷脂0.09 g,膽固醇0.009 g和DSPE-PEG2000 0.0018 g,加入三氯甲烷溶解,置于圓底燒瓶中,旋轉蒸發成膜(45 ℃,轉速為80 r/min),真空干燥2 h,加0.05 mol·L-1,pH6.5的磷酸鹽緩沖液,于恒溫水浴里水化30 min,超聲波細胞粉碎機探頭超聲6 min(150 W),過0.22 μm濾膜,即得莪術醇長循環脂質體。載熒光探針香豆素-6(Coumarin-6,C6)長循環脂質體制備:只需把莪術醇換成香豆素-6即可,其他步驟同莪術醇長循環脂質體。

1.2.3 莪術醇長循環脂質體的表征

1.2.3.1 粒徑和電位測定 取一定量脂質體,稀釋后,置于比色皿中,于激光粒度分析儀中測定,觀察其粒徑和電位及其分布[14-15]。

1.2.3.2 透射電鏡下形態觀察 取脂質體少量,滴加到電鏡專用銅網,放置3 min,吸取過多的樣品,1% 磷鎢酸溶液負染,將銅網自然晾干,在透射電鏡下觀察其形態[16]。

1.2.3.3 包封率的測定 按“1.2.2項”下工藝及處方制備3批莪術醇長循環脂質體。精密量取莪術醇長循環脂質體2 mL,加入透析袋(截留相對分子量8000～14000)中,置于磷酸鹽緩沖液(pH6.5,90 mL)中,每個樣品平行3份,避光,30 ℃恒溫振蕩8 h后,收集透析袋中的液體1 mL,轉移至10 mL容量瓶中,加入適量甲醇超聲破乳,待脂質體結構被充分破壞后,加入甲醇定容。另精密量取1 mL未透析莪術醇長循環脂質體置10 mL容量瓶中,甲醇定容。所得溶液分別過0.22 μm濾孔濾膜,進HPLC檢測莪術醇的含量。計算包封率(EE)[17-18]。

EE(%):為包封率,W1和W2分別表示包封于長循環脂質體中莪術醇的質量和莪術醇的總質量。

1.2.3.4 體外釋放的測定 精密量取莪術醇長循環脂質體,莪術醇脂質體以及莪術醇溶液2 mL,加入透析袋(截留相對分子量8000～14000)中,兩端加緊后置于磷酸鹽緩沖液(pH6.5,30 mL)中,每個樣品平行3份,避光,37 ℃恒溫振蕩。分別于1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h吸取2 mL透析液,并補加等體積磷酸鹽緩沖液[19-20]。按“1.2.1.1”項下色譜條件測定其含量,并計算藥物的累積釋放百分率。

1.2.3.5 放置穩定性 取莪術醇長循環脂質體3批,分別在4 ℃和常溫條件下放置保存,分別于第0、1、2個月取樣,觀察是否有分層、沉淀現象,考察粒徑及藥物含量變化情況[21-22]。

1.2.4 細胞實驗

1.2.4.1 體外細胞攝取實驗 采用熒光強度值定量測定細胞的攝取情況。取對數生長期MDA-MB231細胞加至96孔板,細胞密度為1×105個·mL-1,0.1 mL/孔,培養24 h。用含6.25、12.50、25 μg·mL-1載香豆素6的長循環脂質體和普通脂質體(PEG-Lp-C6,Lp-C6)的完全培養基,空白對照組為完全培養基,在37 ℃下孵育4 h,觀察細胞狀態正常,符合實驗要求,冷PBS洗3次,每次5 min。1% TritonX-100處理細胞45 min,熒光酶標儀測定OD值(激發和發射波長分別為466 nm,505 nm)[23-24]。

1.2.4.2 MDA-MB231細胞毒性實驗 采用MTT法考察脂質體對細胞的毒性[25-26]。取對數生長期MDA-MB231細胞,以1×105個·mL-1的密度接種于96孔板,0.1 mL/孔,37 ℃培養24 h后,按6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1的濃度分組加入載莪術醇的長循環脂質體(PEG-Lp-Cur,Lp-Cur)和莪術醇溶液(Cur)的完全培養基,空白對照組為完全培養基,作用24 h后,每孔加入MTT溶液200 μL,孵育4 h后,每孔加DMSO 150 μL,振蕩10 min。采用酶標儀570 nm波長處測定各孔的OD值,計算細胞存活率(Cell Viability,CV)及IC50。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析,獨立樣本T檢驗法(T-test)考察組間差異。計量數據用Mean±SD表示(n=3)。兩組數據間顯著性差異表示為P<0.05,采用GraphPad-Prism5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 含量測定方法學考察結果

方法學考察結果顯示,HPLC測定系列濃度的莪術醇對照品溶液,以峰面積(A)對濃度(C)進行線性回歸分析,得莪術醇標準曲線:A=35.574C+128.17(r=0.9993),表明莪術醇在10～160 μg·mL-1內峰面積與濃度線性關系良好。方法的日內、日間精密度分別為1.56%、1.87%,均小于2.0%;莪術醇在8 h內的穩定性良好,RSD小于2.0%;高中低三個濃度莪術醇的平均方法回收率為96.8%,RSD小于2.0%;符合HPLC樣品測定的方法學要求?？蛇M行莪術醇含量測定。

2.2 莪術醇長循環脂質體的表征

2.2.1 粒徑和zeta電位測定 脂質體的粒徑和電位如表1和圖1所示。莪術醇長循環脂質體的粒徑(150.3±4.0) nm,PDI為0.197±0.009,粒徑分布較窄,zeta電位(-24.5±0.7) mV,莪術醇長循環脂質體粒徑較莪術醇脂質體稍大,可能是PEG長鏈在脂質體表面形成了一層水化膜的緣故,其表面負電性強于莪術醇脂質體,粒子間的靜電排斥可提高脂質體的分散性,有利于其穩定性。

表1 莪術醇脂質體的粒徑和zeta電位Table 1 The particle size and zeta potential ofLp-Cur and PEG-Lp-Cur

圖1 莪術醇長循環脂質體粒徑分布Fig.1 The particle size distribution of PEG-Lp-Cur

2.2.2 透射電鏡下形態觀察 透射電鏡結果見圖2,莪術醇長循環脂質體外觀形態均為類球形小囊泡,偶見空心囊泡結構,粒子間無聚集現象,分布較均勻。

圖2 莪術醇長循環脂質體透射電鏡形態Fig.2 Morphology of PEG-Lp-Curby transmission electron microscope

2.2.3 包封率測定 制備3批莪術醇長循環脂質體,包封率測定結果見表2。莪術醇長循環脂質體的平均包封率為80.24%,表明制備工藝穩定可行。

表2 包封率測定結果(%)Table 2 Results of determination of entrapment efficiency(%)

表3 莪術醇長循環脂質體在常溫條件下的穩定性(n=3)Table 3 Stability of PEG-Lp-Cur at room temperature(n=3)

表4 莪術醇長循環脂質體在4 ℃條件下的穩定性(n=3)Table 4 Stability of PEG-Lp-Cur at 4 ℃(n=3)

2.2.4 體外釋放的測定 莪術醇體外釋放結果見圖3。在1 h時,游離莪術醇溶液、莪術醇脂質體及莪術醇長循環脂質體的累積釋放率分別為96.40%、19.96%和13.70%,HPLC法測定莪術醇長循環脂質體在初期釋放較慢,可能是PEG在脂質體外形成的水化膜而減慢藥物的釋放,72 h累積體外釋放百分率為52.6%,與脂質體釋放基本一致。原因可能是脂質體本身可使藥物具有一定的緩釋作用,加之莪術醇為脂溶性藥物和釋放介質的影響,使得藥物釋放緩慢[27]。

圖3 莪術醇長循環脂質體的體外釋放曲線Fig.3 The curve of release of PEG-Lp-Cur in vitro

2.2.5 放置穩定性 結果見表3和表4,莪術醇長循環脂質體在常溫條件下存放2個月,有較多沉淀產生,振搖亦不可完全復原,粒徑有較大幅度增大,藥物含量下降明顯。在4 ℃條件下存放2個月,有少量沉淀和絮凝產生,經振搖可復原,均勻性良好,含藥量為79.76%,粒徑變化不大。結果表明,莪術醇長循環脂質體在4 ℃條件下穩定性較好。

2.3 體外細胞攝取實驗

為了考察長循環脂質體的體外靶向性,以普通脂質體作為對照,定量觀察MDA-MB231細胞對包載香豆素-6的長循環脂質體攝取情況。在37 ℃條件下,結果如圖4所示,隨著香豆素-6濃度的增加,MDA-MB231細胞對載有香豆素-6的長循環和普通脂質體的攝取量逐漸增大,提示MDA-MB231細胞對長循環和普通脂質體的攝取呈濃度依賴性,并且在香豆素-6相同濃度下MDA-MB231細胞對長循環脂質體攝取明顯高于普通脂質體。提示DSPE-PEG2000可能增加了MDA-MB231細胞對脂質體的攝取[28]。

圖4 MDA-MB231細胞對脂質體的細胞攝取效率(n=3)Fig.4 Cellular uptake efficiency of the liposomeson MDA-MB231 cells(n=3)注:組間比較，*表示具有顯著差異,P<0.05。

2.4 細胞毒性實驗

圖5 莪術醇對MDA-MB231細胞的細胞毒性評價Fig.5 Cytotoxicity of curcumolon MDA-MB231 cells in vitro

莪術醇各種制劑的細胞毒性如圖5所示。與空白對照組對比,莪術醇各制劑組隨藥物濃度的增加細胞毒性均明顯增強,莪術醇長循環脂質體的體外抗腫瘤活性強于同濃度的莪術醇普通脂質體和游離莪術醇,經計算Cur、Lp-Cur和PEG-Lp-Cur的半數抑制濃度(IC50)分別為45.14、23.50、10.22 μg·mL-1。表明莪術醇包載于脂質體后可以提高其體外抗腫瘤活性,尤其是經DSPE-PEG2000修飾后的長循環脂質體,體外抗腫瘤活性更強。機制可能與長循環脂質體能夠顯著提高乳腺癌細胞對莪術醇的攝取和延長莪術醇在乳腺癌細胞中的滯留時間有關。在機體中聚乙二醇(PEG)修飾的脂質體可以減少網狀內皮系統(RES)吞噬細胞的攝取,經實體腫瘤新生血管的滲透滯留增強作用(EPR)實現腫瘤靶向[29]。

3 討論

本研究采用薄膜分散法制備了莪術醇長循環脂質體,粒徑分布較集中,分散較為均勻,制備3批脂質體,平均包封率為80.24%,體外釋放緩慢具有明顯的緩釋效應,可能由于DSPE-PEG2000的加入脂質體中,伸展的PEG長鏈在脂質體表面形成了一層水化膜,導致藥物釋放減慢[21]。在4 ℃條件下存放2個月粒徑和含藥量無明顯變化,穩定性較好,符合制備工藝要求。

細胞攝取實驗中,由于莪術醇無熒光,無法觀察腫瘤細胞對莪術醇長循環脂質體的攝取情況,故采用載香豆素-6的長循環脂質體考察MDA-MB231細胞對長循環脂質體的攝取情況。人三陰性乳腺癌MDA-MB231細胞對長循環脂質體的體外攝取作用優于普通脂質體,這可能與長循環脂質體表面的PEG鏈的水化作用和細胞有更好的親和力有關,增加了細胞對長循環脂質體的攝取[29]。

細胞毒性實驗中,莪術醇長循環脂質體的體外抗腫瘤活性強于同濃度的莪術醇普通脂質體和游離莪術醇,推測可能與脂質體能改善莪術醇在水中的溶解度和延長莪術醇在胞內的滯留時間有關,從而發揮更強的抑制腫瘤細胞作用,另外長循環脂質體可通過增加細胞攝取,進而發揮莪術醇對MDA-MB231細胞的毒性作用[30],故表現出較強的腫瘤細胞毒性作用。

4 結論

本研究通過薄膜分散法制備莪術醇長循環脂質體,外觀形狀規整均一,理化性質穩定,包封率較高;體外釋放具有緩釋效果,穩定性較好;長循環脂質體具有比普通脂質體更高的攝取效率;體外細胞毒性實驗證明了載藥脂質體制劑對MDA-MB231細胞的毒性具有濃度依賴性,在相同濃度下,莪術醇長循環脂質體IC50值明顯低于莪術醇普通脂質體和游離莪術醇,說明莪術醇長循環脂質體具有較強的MDA-MB231細胞的毒性,證明了莪術醇長循環脂質體的抗人三陰性乳腺癌細胞作用。

以上研究結果表明,長循環脂質體能高效包載莪術醇,改善其在水中的溶解度,增加其穩定性,提高腫瘤細胞對莪術醇的攝取,體外抗腫瘤作用較強,為后續進行藥物代謝動力學研究和荷瘤鼠體內藥效學的研究打下基礎。