磺胺類抗生素分子印跡制備技術與應用進展

李心悅,張譯豐,賴靜嫻,蔡湘萍,梁清文,賴 婷,徐振林,韋曉群

(廣東省食品質量安全重點實驗室,華南農業大學食品學院,廣東廣州 510640)

分子印跡技術(molecular imprinting technique,MIT)是指制備對某一特定的目標分子具有特異識別位點的聚合物的過程[1]。分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer,MIP)的特別識別位點模仿了抗體或酶等生物體間的識別機制,模板分子與聚合物單體在合適的反應體系中混合后,功能單體與模板分子通過氫鍵、靜電作用、疏水相互作用等分子間作用力形成結構互補的有序排列,通過交聯劑使功能單體聚合,形成聚合物,最后從聚合物中除去模板分子可得到具有對模板分子有特異吸附鍵合位點的分子印跡聚合物[2-3]。MIP的高穩定性和對大多數目標分析物有效的通用性使它適用于眾多成分的檢測。

目前MIP已被廣泛應用于食品中獸藥殘留的分析檢測。已被作為模板分子研究的抗生素包括天然抗生素β-內酰胺類抗生素[4]、大環內酯類抗生素[5]、四環素族抗生素[6]等和合成抗生素喹諾酮類抗菌藥物[7]、磺胺類抗生素[8]等,幾乎涵蓋所有養殖用藥領域?；前奉惪股?sulfanilamide,SAs)作為一種與對氨苯甲酸(p-aminobenzoic acid,PBPA)結構類似[9]的抗生素,具有抗菌譜系廣、價格便宜[10]的特點,被作為獸藥廣泛應用于預防和治療細菌和病毒引起的動物疾病和原生動物感染疾病[11]。歐洲是磺胺類藥物使用最為廣泛的地區之一,每年在豬的飼養中使用的磺胺噻唑就高達400000 kg,磺胺二甲嘧啶的使用量也高達350000 kg[12]。由于磺胺類藥物被頻繁使用甚至違規濫用,它已成為目前最常被檢出的抗菌類藥物之一。為解決磺胺類抗生素濫用的問題,動物性食品中的磺胺類藥物的最大殘留量(maximum residue limit,MRL)被規定為100 μg·kg-1[13]。為了實現磺胺類藥物檢測標準化,我國制定高效液相色譜法[14]的國家標準(GB 29694-2013),這一檢測方法準確性高,但是前處理步驟復雜,使用具有特異性的MIP作固相萃取材料可有效簡化樣品前處理步驟,Rozaini等[8]使用分子印跡薄膜,實現了對水樣中SAs的直接檢測,同時,MIP處理后的樣品還存在富集率高、選擇性好等優點,有效地降低了樣品中復雜基質對待測物檢測結果的干擾,在Xu等[15]的研究中,使用MIP后,豬肉等肉類樣品的檢測限達0.20～0.72 μg/kg,儀器檢測精度高。因此,MIP在磺胺類藥物的檢測中具有重要的應用價值。

本綜述對各磺胺類抗生素分子印跡聚合物的制備條件進行了收集和匯總,分析在不同優化條件下分子印跡聚合物的結構和性能差異,總結了其在各樣品檢測中的多種應用模式,并對其優缺點及發展前景進行綜述。

1 磺胺類藥物分子印跡聚合物的反應體系研究現狀

1.1 模板和功能單體的選擇

磺胺類抗生素由對氨基苯磺酰胺和取代了磺酰胺基上一個氫的雜環基團(用R指代)兩部分組成[16],可作用位點如圖1所示,包括可與功能單體形成氫鍵作用力的氨基和硫氧鍵,以及能與部分功能單體或交聯劑形成疏水作用力和п-п相互作用力的苯環。

圖1 磺胺類藥物的結構圖Fig.1 Structure of sulfonamides

磺胺類抗生素的結構特點決定了它的分子印跡聚合方法多屬于非共價型聚合,這一聚合方法的分子間相互作用力弱,要求模板分子的功能位點個數適中,在模板與功能單體間有足夠作用強度的同時,避免模板分子與功能單體的結合過于牢固而導致的模板分子難以從MIP中除去的情況。除此之外,分子印跡還要求模板分子具有較高的溶解性?；前粪奏?sulfadiazine,SD)[17-20]、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine,SMZ)[15,21-22]、磺胺二甲氧基嘧啶(sulfamethazine,SDM)[23-24]同屬磺胺嘧啶類抗菌劑,三種化合物結構相似,溶解性較好,R基團嘧啶環上的兩個胺基可提供兩個氫鍵結合位點,可輔助磺胺基上的四個氫鍵結合位點形成穩定的非共價型絡合結構,有利于MIP特異性空腔的形成,因此,如圖2所示,擁有嘧啶雜環的磺胺類抗生素作為模板分子的頻率,達57%,即一半的磺胺類抗生素分子印跡的模板分子都屬于磺胺嘧啶類。一方面,這是因為其化學性質的適配性,另一方面,這是由市場應用情況決定的,SD、SMZ和SDM作為中效抗菌劑,使用范圍廣泛,殘留情況相對嚴重[12],用它們制備的MIP具有更高的實用性?；前芳讎f唑(sulfamethoxazole,SMO)[25]作為磺胺類抗生素中的常用藥,同樣存在較嚴重的藥物污染問題,而且其噁唑雜環也可為MIP提供兩個氫鍵結合位點,是較為理想的模板分子材料,因此,磺胺甲噁唑也常被用作MIP的模板分子,其占比高達19%。

圖2 磺胺類分子印跡模板分子使用情況Fig.2 Usage of template moleculein sulfonamide molecularly imprinted注：該圖以JCR I、II區文獻為主要統計數據,2002～2018年。

功能單體與模板分子在有機介質中識別程度的差異也是選擇模板分子的影響因素之一[24],由于功能單體的pH、極性、結構等存在差異,不同的磺胺類模板分子與功能單體間的絡合效果也有所不同。在已有的報道中,甲基丙烯酸(methacrylic acid,MAA)的使用頻率最高,這可能與磺胺二甲基嘧啶被作為磺胺類抗生素分子印跡的常用模板分子有關。對比表1 MIP-1和MIP-2發現,當SMZ和MAA分別作為模板分子和功能單體時,MIP的選擇性顯著。Isarankura-Na-Ayudhya等[26]使用計算機模擬技術,對這一現象進行分析,發現MAA與磺酰胺部分的結合能達-91.9364 kJ/mol,比1-乙烯基咪唑與磺酰胺部分的結合能高一倍,而當功能單體與模板分子間能量較高時,MIP的結合位點親和力更高[27]。由于磺胺類抗生素分子印跡選用的模板結構多與SMZ類似,所以MAA功能單體在磺胺類分子印跡中普遍適用。但是,MAA作為一種可同時成為氫鍵供體和受體的功能單體,MAA和MAA之間的結合能很高[26],當模板分子與MAA間的結合能不足時,MAA容易自聚,MIP效果反而不理想。表1 MIP-5顯示,當SMO作為模板分子時,功能單體MAA并不能為MIP帶來較好的特異性。除此之外,將表1 MIP-1、MIP-2和MIP-3的實驗結果進行對比,還可以發現,功能單體的復合使用對MIP的吸附性能和選擇性有了很大提升[28-29],乙烯基功能單體的復合使用為磺胺類分子印跡的優化提供了更多可能。

表1 模板分子和功能單體對分子印跡聚合物特異性的影響Table 1 Effects of template molecules and functional monomers on the selectivity of molecularly imprinted polymers

近年來,為解決乙烯基功能單體聚合的MIP易受強極性溶劑干擾的問題,部分報道提出了選用非乙烯基功能單體的研究思路。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTEs)[18]、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(KH570)[22]等需要使用溶膠-凝膠法聚合的硅烷偶聯劑功能單體,還有三聚氰胺和間苯二酚[30]等的水溶性親水性功能單體都屬于新型非乙烯基功能單體。這一類型的功能單體區別于MAA、4-VP等傳統乙烯基功能單體,擁有較多的羥基和可在水相環境下聚合的能力,可有效抑制強極性環境對自身的干擾。除此之外,擁有特殊性質的功能單體還可以賦予MIP特殊的控制性性能。Chen 等[17]利用4-[(4-甲基丙烯酰氧基)苯基偶氮]苯磺酸(4-[(4-methacryloyloxy)phenylazo]benzenesulfonic acid,MAPASA)中的偶氮苯留色子可在指定光波長下發生異構化的特點,通過光波長的變化改變其識別位點的空間排列,使得MIP具有控制模板分子結合和釋放的能力,設計出了以它作為功能單體的光敏分子印跡聚合物。功能單體種類選擇和創新應用是分子印跡制備中的一個重要課題。

1.2 交聯劑的選擇

交聯劑的作用是固定模板分子周圍的功能單體及其官能團,從而形成高度交聯的剛性聚合物。交聯劑的使用量對于分子印跡聚合物的結合能力和構型都有著顯著的影響,過低易造成聚合物的結構坍塌,過高則不利于具有選擇性空腔的形成[31]。在磺胺類藥物的乙烯基聚合過程中,最常用的交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate,EGDMA),其他交聯劑如N,N-二甲基甲酰胺[32]和二乙烯基苯(divinylbenzene,DVB)[24]則只在部分文獻中出現。最新研究中開發的溶膠-凝膠聚合法,如表2[8,18,33]所示,主要使用正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS)作交聯劑,通過摻雜熒光量子點,利用熒光信號強度對SAs進行定性定量檢測。因為TEOS聚合條件為常溫、堿性,而SAs在低溫堿性條件下性質穩定,所以區別于乙烯基60 ℃的聚合條件[28-29],TEOS作交聯劑能有效防止SAs在MIP聚合過程中分解的情況,為MIP形成穩定印跡位點提供保障,除此之外,二氧化硅表面含有豐富的羥基[34],可為SAs提供除功能單體外的作用基團,強化印跡效果。

1.3 致孔劑的選擇

致孔劑的物理和化學特性對模板分子和功能單體的預聚合具有顯著影響力,是決定分子印跡聚合物能夠有效分子識別的最重要的因素之一。對于非共價型分子印跡,水相的溶劑聚合環境會降低分子印跡的吸附效果[24],因此非共價型磺胺類分子印跡制備時,多選用非中等極性或非質子溶劑,如甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙腈等,避免干擾模板分子和功能單體間的絡合作用。

目前,非共價型磺胺類分子印跡的制備多使用乙腈[8,23,33]作為致孔劑,但嵇大圣[35]通過Tomasi極化統一模型(polarized continuum mode,PCM)模擬計算發現,MAA和磺胺在乙腈中的溶劑化能比在氯仿、苯和丙酮中大,即高介電常數的乙睛溶劑不利于磺胺模板與MAA之間相互絡合。部分研究就該問題開始探索新型溶劑,如異辛烷[32]等。Guo等[36]以四氫呋喃作溶劑制得檢測限為1 ng/g,定量限為3.5 ng/g的分子印跡聚合物,證明了在分子印跡聚合物的致孔劑、溶劑的種類選擇上具有廣闊的研究空間。

2 磺胺類藥物分子印跡聚合物合成方法的研究現狀

分子印跡制備方法包括:本體聚合法、原位聚合法、沉淀聚合法、分散聚合法、二維分子印跡技術和表面分子印跡技術[37]。最常用于磺胺分子印跡的方法分別是本體聚合法和表面印跡法,但因為本體聚合法擁有作用位點易包埋、成品處理困難等缺陷,僅適用于基礎研究[28-29],所以創新應用型的研究傾向于使用表面印跡法。

表面分子印跡技術是通過接枝、化學改性、涂覆等方法使印跡識別點分布在基體表面的一項技術,解決了傳統方法包埋識別位點造成應用效率不高的問題。表面分子印跡的制備過程可分為三部分,分別是基體、基體表面改性以及印跡?；w的選擇與分子印跡的用途相關,目前常用于磺胺表面分子印跡的基體包括:硅膠或二氧化硅[38-40]、磁珠[41-42]以及其他基體(如:電極[43-44]和高聚物[24,45]等),具體使用情況如表2所示。

表2 磺胺類藥物分子印跡聚合物的研究現狀Table 2 Research status of sulfonamide molecularly imprinted polymers

2.1 硅膠表面分子印跡

硅膠作為基體的分子印跡聚合物可作為色譜柱填料應用于固相萃取、色譜分離、吸附劑等多個前處理領域。目前,以硅膠為基體的表面分子印跡是研究重點,共分為兩類,分別是:

2.1.1 傳統二氧化硅基體分子印跡 對納米二氧化硅顆粒、二氧化硅毛細管柱等傳統的二氧化硅產品[15,21]進行表面分子印跡改性,可有效增大分子印跡的比表面積,有效提高印跡作用位點的吸附效率和利用率。納米二氧化硅顆粒被硅烷偶聯劑進行表面改性,制備出一種包裹著一層印跡膠束結構的球形二氧化硅納米顆粒[15],受基體形貌限制,成品僅作為SPE填料使用,但基體改性方式多,如:具有選擇性的新型限制性存取分子印跡材料(Restricted access-molecularly imprinted material,RA-MIP)[40]。二氧化硅毛細管柱則可被印跡層涂覆覆蓋,作為選擇性的萃取攪拌棒使用,有效增加了印跡的應用途徑。這一類型的印跡有較高的吸附效率和利用率,但本質還是乙烯基聚合的分子印跡聚合物,易受水的影響,需在有機溶劑環境中使用。

2.1.2 新型二氧化硅分子印跡 溶膠-凝膠法在含水介質中合成分子印跡二氧化硅(molecularly imprinted silica,MIS)。這類聚合物受水等強極性溶劑的影響較小,一定程度上保留了應用于模板分子和功能單體在強極性溶劑環境下的絡合能力。Ding等[18]將MIS與表面印跡有機結合,先讓TEOS在水中進行初步聚合,形成摻雜熒光量子點的核殼結構,隨后加入模板分子SD、功能單體APTEs形成印跡層,得到摻雜熒光量子點的MIS。由于MIS在聚合階段是在水中進行的,因此使用MIS萃取水性樣品時,模板SD的IF值遠高于另外5種磺胺類藥物,特異性顯著。除此之外,MIS還衍生出了凝膠薄膜的狀態[8],該產品在針對水性樣品進行檢測時,檢測限低至0.06 μg/L,靈敏度優于大部分商用免疫檢測產品[46],這一發現,使分子印跡聚合物有望成為獨立的產品,對分子印跡應用領域的進一步擴展起到了積極的作用。

2.2 以磁性顆粒為基體的表面分子印跡

磁性顆粒表面分子印跡聚合物是一種以磁珠為核心,油酸[42]或二氧化硅為連接層,分子印跡為外殼的核殼結構[47]聚合物。這個基體的制作流程則與傳統表面印跡方法類似,但需要注意的是,因為磁珠不能與印跡層直接連接,所以磁性顆粒表面分子印跡不能如硅膠般根據使用需求進行形貌結構調整。磁性顆粒作基體的分子印跡聚合物體積普遍較小,Zhao等[48]延用了他在制備2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷印跡聚合物時的方法,制備出內徑70 nm、外徑150 nm的核-殼納米氨基官能化磁性印跡聚合物(CS-NR-Mag-MIP)[43],檢測限低至0.004 μg/L。這個表面印跡方法在保留了二氧化硅表面印跡的比表面積大的優勢的同時,可利用磁性實現MIP與樣品的快速分離,具有使用步驟少,操作方便的優點。崔一笑[49]利用磁性顆粒MIP可在外加磁場的作用下集中吸附于一處的特點,簡化固相萃取步驟,利用磁性基質固相萃取方法分別對雞肉、牛奶、羊奶樣品進行檢測,回收率分別為82.27%～120.93%、78.67%～98.90%、62.66%～94.73%,回收效果較好,但是通過表2發現,與其他基體的MIP相比,這類型的分子印跡聚合物回收率效果中等,部分成品存在檢測限高的問題[42],這可能是因為磁珠間存在磁性吸附關系,導致磁性MIP易發生團聚,磁性MIP的印跡層利用率相對下降。

2.3 以其他物質為基體的表面分子印跡

通過使用分子印跡對化學傳感器的電極進行改造,可使電化學傳感器有選擇的對樣品中的目標物質進行定量檢測,實現電化學傳感器檢測的定性定量分析。在電極表面進行印跡需要將MIP用低沸點的溶劑分散在電極表面,經過干燥、拋光、水洗等步驟[44],在溶劑揮發后電極表面形成一層印跡薄膜,即可得到改性電極,通過研究,已出現了改性碳糊電極(carbon paste electrode,CPE)、石墨烯氧化物(graphene oxide,GO)改性的玻碳電極(glassy carbon electrode,GCE)[50]、改性的表面聲波(surface acoustic wave,SAW)芯片的金電極[45]等,這些電極與電化學傳感器結合使用,能有效抑制樣品中雜質對檢測結果的干擾、檢測結果穩定、重現性好、靈敏度高。

至于以聚合物為基體的分子印跡聚合物,主要能起到增大印跡應用面積,拓寬印跡使用途徑的目的。Chen等[45]和Diaz-Alvarez等[24]分別嘗試了聚苯乙烯種子微球和聚丙烯中空纖維作基體,制備出的聚合物通過對不同組分的提取效率差異,有效分離樣品中的各磺胺類抗生素,但如表2所示,該類聚合物的檢測限僅有0.2～3 μg/L[24]，略遜色于另外幾種基體。

3 磺胺類藥物分子印跡聚合物在樣品分析中的應用

自從Sellergren使用MIP從尿液樣品中萃取出潘他米丁[8],MIP作為固相萃取材料得到了廣泛而深入的研究,隨著市場對快速檢測產品的需求增加,磺胺類抗生素分子印跡的應用正逐漸簡化,朝快速檢測產品方向轉變。

3.1 作為固相萃取柱的應用

磺胺類藥物作為水產品養殖業、畜牧業中的抗菌劑使用,多出現在畜牧類產品中,部分藥物通過養殖用水流入環境,因此,該藥物的檢測樣品集中在環境樣品和食品樣品中。

MIP作為固相萃取材料應用在禽畜類產品中時,步驟最復雜。禽畜類產品包括牛奶[51-52]、雞蛋[53]、肉[54]等,富含蛋白質、脂質和纖維等大分子,在使用MIP富集前,一般需進行初提取以排除樣品中的大分子對MIP的干擾。牛奶可用少量乙酸鉛溶液沉淀并除去蛋白質[51],禽畜肉類則需要經歷均化、吸水、多種溶劑反復提取、蒸發復溶等一系列步驟[55]。這一類樣品的初提取普遍用時長、步驟復雜,萃取效率受待測物在提取劑中的溶解度等因素影響。若MIP能排除大分子干擾,使禽畜類樣品無需經過復雜的初提取步驟即可直接應用,可有效簡化MIP使用程序,提高MIP使用效率。

水產品樣品和土壤樣品同樣需要進行初提取后才能被MIP富集目標成分,但相比禽畜類產品的初提取步驟,水產品樣品和土壤樣品的初提取步驟更簡單,只需要使用能快速提取目標分子的有機溶劑提取即可[56]。唯一的難點主要集中在水產品樣品中含水量較高,易出現MIP特異性降低的現象,這個缺陷可通過把MIP制作成固相萃取柱,通過調整洗滌溶劑的極性和流速,實現樣品中各組分的有效分離[57-58]。Shi等[23]制備的MIP靜態吸附時選擇性較差,但正是利用了各組分在相同溶劑環境下與功能基團作用力的差異,有效分離了樣品中的各磺胺類藥物。方法利用了洗滌溶劑在固相萃取過程中,能在破壞分析物與功能基團間相互作用力的同時,保留目標待測物和印跡位點的鍵合能力[59-60]的特點,目標分子及其結構類似物在MIP固相萃取柱中擁有比其他結構更慢的洗脫速度,從而有效區分目標分子及其他組分,同樣適用于水性樣品的直接應用。

3.2 在水性樣品中的直接應用

理論上,MIP固相萃取柱可以讓實際含水樣品無需經過有機溶劑的提取直接使用,但是真實水樣中存在多種雜質,如酸或者鹽等,都會對MIP的選擇性進行破壞,降低回收率[61]。對于這類雜質,可以調節水性樣品的pH或者讓水性樣品先通過常規吸附劑(如C18,DVD)進行初步除雜,之后MIP固相萃取柱對各成分進行吸附提取,并和水產品樣品一樣,選用一種不會破壞MIP各功能位點和待測目標物的洗滌劑,誘導空腔對目標分析物進行選擇性保留,最后收集MIP中的目標檢測物,實現對樣品中各組分有效分離[62-64]。一般在檢測磺胺類藥物的時候,選用甲醇水溶液作洗滌劑除去雜質[65],甲醇的比例隨MIP保留能力強度的加強而加強。乙酸∶甲醇(5∶95,v/v)作為洗脫劑萃取,該比例下的甲醇溶液能最大程度上回收MIP中的磺胺類藥物[66]。

圖3 手性向列型印跡復合膜的制備和應用流程Fig.3 Preparation and application process of chiral nematic imprinted composite membrane

隨著MIS的發展與應用,分子印跡逐漸擺脫傳統乙烯基聚合法易受水影響導致特異性下降的限制。制備溶劑為水的MIS受水強極性影響較小,摻雜熒光量子點后與熒光檢測器聯合使用,可在提高靈敏度的同時減小樣品的除雜步驟,部分報道中,水性樣品只需要經過簡單的過濾步驟即可直接使用MIS萃取目標物質[18,33]。MIS的出現進一步簡化了分子印跡的使用流程,提高了分子印跡聚合物成為一種針對水性樣品的獨立快檢產品的潛力。

3.3 作為快檢方法的應用研究

分子印跡技術的基本原理是模仿免疫抗原抗體相結合的特性衍生出的仿生技術,MIS[18,33]和電極[44-45]為基體的分子印跡聚合物一定程度上可作為一種快檢產品直接使用,但由于吸附現象不顯色、現象不明顯等缺陷,需要依附檢測儀器使用,無法像免疫抗原抗體法一樣制備出膠體金一類的快速檢測用的試紙條,不利于推廣。部分研究為解決磺胺類藥物分子印跡聚合物的應用問題進行探索。Zhang等[67]基于納米晶體纖維素模板化的分子印跡樹脂制造光學磺酰胺傳感器技術,合成了手性向列型印跡復合膜,該薄膜通過手性向列結構中重新印刷的印跡位點,對磺胺類藥物產生黃色變化反應,觀察該薄膜的顏色反應后,可直接選擇出磺胺類藥物(圖3)。手性向列型印跡復合膜對磺酰胺有選擇性,與免疫抗原抗體法中的試紙條效果相似,有廣泛推廣使用的潛力,但其檢測限范圍高達0.05～10 mg/mL,靈敏度不如儀器分析法,若能有效提高該技術的靈敏度,磺胺類抗生素分子印跡快速檢測技術將有望實現進一步的推廣和應用。

4 結語

分子印跡聚合物的穩定性、制作周期短、低成本和特異選擇性使其能在一定程度上替代酶聯免疫技術,目前,分子印跡聚合物用于磺胺類藥物的分析檢測已被大量報道?；前奉惪股胤肿佑≯E的優化可通過分析模板分子和功能單體間的非共價作用力,選用作用位點適中、易形成穩定空腔結構的模板分子、功能單體和交聯劑,實現分子印跡聚合物性能的優化。

磺胺類抗生素分子印跡還可以通過調整制備工藝進行優化。制備工藝和應用模式存在聯系,傳統的制備工藝,如本體聚合物法，以二氧化硅、磁珠、高聚物等作為基體的表面分子印跡聚合法等制備的MIP多作為固相萃取材料,應用于常規肉類食品之中,這部分的技術最為成熟,部分技術已轉化為產品投入市場,如:MIP Technologies(瑞典Lund)和Semorex(North Brunswick,NJ,USA)[68]等。溶膠-凝膠法制備的MIS則是分子印跡技術在水性樣品中使用的主要趨勢,雖然在大多數情況下,目標分子在水性介質中的直接選擇性結合仍然是困難的案例,但具有成為快速檢測單一產品的潛力。此外,基于納米晶體纖維素模板化的分子印跡樹脂制造光學磺酰胺傳感器技術合成的手性向列型印跡復合膜,使分子印跡技術能以試紙條的形式應用于實際樣品,有望實現磺胺類分子印跡技術的商業化,但目前該技術仍有改進空間。