GC-MS與 電子感官結合對煙熏液風味物質的分析

宋 麗，陳星星，谷風林，胡 可，吳桂蘋，朱秋勁,*，陶 銳

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025；

2.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；3.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；4.國家重要熱帶作物工程技術研究中心，海南 萬寧 571533；5.海南省熱帶香料飲料作物工程技術研究中心，海南 萬寧 571533；6.海南海墾胡椒產業股份有限公司，海南 ?？?571100）

煙熏液具有賦予食品煙熏風味的作用[1]，且在應用到食品之前，已經定向除去了多環芳烴等化學危害物，因而被消費者 所喜愛。一直以來，煙熏調味料作為商業調味添加劑被廣泛運用于各種食品，如魚類、肉類、乳制品、堅果和零食等，其化學成分與感官特性之間的關系是食品風味科學家們一直關注的問題，尤其在煙熏調味料的化學成分研究方面，取得了很大發展[2]。姜紹通[3]、吳靖娜[4]等采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術測定煙熏液中揮發性成分，發現酚類化合物對煙熏風味的貢獻最大，這與Guillen[5]和Giri[6]等的研究結果相似。有學者匯總了近年來有關煙熏液風味成分文獻，發現煙熏液中的主要成分有酚類、羰基類、有機酸類、醇類及酯類等化合物[7]，這些成分相互作用，在一定程度上改變了食品的感官特性包括味道、質地和顏色以及保質期[8]?；跓熝涸谑澄镏行纬赡承┨匦缘哪芰θQ于其所含成分的性質和濃度[9]，而商業煙熏液的化合物種類復雜多樣，且含量各不相同。因此，充分了解煙熏液中的化學成分對食品開發人員在特殊的食品基質中選擇合適的煙熏液具有重要的意義和價值。

目前關于煙熏液風味分析報道中，GC-MS技術為分析煙熏液風味成分的主要手段，但該技術只能檢測單一物質揮發性組分，具有一定的局限性[10]。電子鼻技術具有模仿人類嗅覺系統的功能，可以對復雜氣味進行檢測和識別[11]。電子舌作為一種模擬人體味覺系統對食品進行評價和檢測技術，現已廣泛用于食品、醫藥等領域[12]。目前將GC-MS結合電子鼻、電子舌技術分析煙熏液的研究鮮見報道，因此，為使研究人員更好地了解煙熏液的復雜成分，本研究以9 種不同商業煙熏液為研究對象，采用GC-MS聯用技術結合電子鼻和電子舌技術對其風味物質系統比較和分析，旨在探究不同類型煙熏液中風味物質的種類及濃度，尋找不同煙熏液風味物質的差異，為商業煙熏液在實際食品加工運用中提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂核煙熏液I號、II號、II-2002、II-2003 濟南華魯食品有限公司；紅箭煙熏液Smokez poly C-10-03（C-10-03）、Smokez poly C-10-05（C-10-05）、Smokez poly C-10-10（C-10-10）、Smokez poly C-10-11（C-10-11）、Smokez poly C-10-22（C-10-22） 美國紅箭公司；2-辛醇（99%）、二氯甲烷（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；C7～C40正構烷烴標準品 美國o2si公司。

1.2 儀器與設備

7890B GC儀 美國Agilent公司；LECO Pegasus HT MS儀 美國LECO公司；α-Gemini型電子鼻 法國Alpha MOS公司；HS-100型自動進樣器 瑞士CTC公司；Avanti JXN-26高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特商貿有限公司；SA-402B味覺分析系統 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻傳感器性能

電子鼻傳感器的性能描述如表1所示。

表1 電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance of 6 electronic nose sensors

1.3.2 電子鼻檢測條件

參考王瓊等[13]的方法，取2.5 mL煙熏液樣品于10 mL頂空瓶中，在室溫下平衡10 min進樣分析。頂空加熱溫度65 ℃；加熱時間180 s；延滯采集時間600 s；數據采集時間120 s；采集周期1.0 s；流速150 mL/min；每個樣品做3 次重復。

1.3.3 電子舌檢測條件

采用2 步清洗法。清洗溶劑90 s，清洗溶劑120 s，清洗溶劑120 s，調節溶劑30 s，樣品液30 s，清洗溶劑3 s，清洗溶劑3 s，標準溶液30 s。

1.3.4 煙熏液風味物質的測定

1.3.4.1 樣品前處理

參考李琦等[14]的方法，稍作修改。吸取煙熏液3 mL置于離心管，加入二氯甲烷、再加入一定濃度的內標2-辛醇，2 000 r/min旋渦混合10 min、直立放入冰箱進行萃取，取出解凍，3 500 r/min離心10 min，吸取下層有機相過無水硫酸鈉后，過0.22 μm有機濾膜進儀器分析，每個樣品重復3 次，將得到的數據取平均值。

1.3.4.2 GC-MS條件

GC條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.250 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；進樣量1 μL；分流比20∶1；載氣（He）流速1.0 mL/min；程序升溫：50 ℃保持0.5 min，以3 ℃/min升溫至100 ℃，以6 ℃/min升溫至230 ℃，保持20 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；四極桿溫度180 ℃；傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲6 min；質量掃描范圍m/z35～500。

1.3.4.3 定性分析

將C7～C40正構烷烴標準品在與樣品相同的進樣條件下進行分析，獲得保留時間，按式（1）計算保留指數[15]：

式中：n為碳原子數；tx為待測組分的保留時間/min；tn為碳原子數為n的正構烷烴保留時間/min；tn+1為碳原子數為n+1的正構烷烴保留時間/min；tn－1為碳原子數為n－1的正構烷烴保留時間/min。

1.3.4.4 定量分析

根據己知的內標化合物濃度對揮發性風味組分進行半定量分析，依據化合物的峰面積比值與含量呈正比的原理，按式（2）計算每一種揮發性風味組分相對于內標化合物的含量[16]：

式中：Cx為未知揮發性風味組分質量濃度/（mg/L）；C0為煙熏液中內標化合物質量濃度/（mg/L）；Sx為未知揮發性風味組分峰面積；S0為添加的內標化合物峰面積。

1.4 數據處理

電子鼻數據利用Alpha Soft V12.0軟件進行分析；GC-MS采用工作站自帶數據處理軟件進行處理，實驗數據經過Microsoft Excel 2013進行整理；電子舌結果采用SPSS 24.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA），采用Origin 2018進行相應繪圖。

2 結果與分析

2.1 電子鼻測定結果

圖1 傳感器的感應強度雷達圖Fig. 1 Radar graph for odor intensity of nine liquid smokes measured by electronic nose

從圖1可以看出，9 種不同煙熏液樣品的風味輪廓相似，但每個傳感器對香氣的響應強度都有所不同[17]，且各樣品的香氣成分有一定的差別，其中傳感器PA/2和T70/2響應峰值較大，說明不同類型煙熏液中的有機化合物和芳香族化合物風味較為明顯，而PA/2又遠高于T70/2，且II-2003＞II號＞I號＞II-2002＞C-10-10＞C-10-11＞C-10-03＞C-10-05＞C-10-22，前4 種煙熏液在PA/2的響應值幾乎聚集在一起，說明這4 種山楂核煙熏液在風味上具有一定的相似性。而后面5 種紅箭煙熏液響應值較為分散，原因可能是煙熏液中風味物質不同而引起香氣的差異。2 組不同類型煙熏液的香氣響應值存在的異同，可能是由于紅箭煙熏液在提取風味物質時，由于提取方法的不同，從而引起煙熏液中有機化合物和芳香族化合物的數量在某種程度上的變化。

2.2 電子舌測定結果

表2 電子舌對不同類型煙熏液的響應分析Table 2 Electronic tongue responses to different liquid smokes

由表2可知，6 種滋味傳感器對7 種不同類型的煙熏液滋味均有響應，但敏感程度各有不同，其中2 組煙熏液在咸味上存在明顯差異（P＜0.05），且紅箭煙熏液強于山楂核煙熏液；而對于酸味、澀味和鮮味，C-10-03和C-10-10兩種煙熏液與其余5 種煙熏液差異明顯，且這2 種煙熏液酸味稍弱于其他5 種煙熏液，而澀味和鮮味則高于其他5 種；對于苦味，這7 種類型的煙熏液存在較大差異，而豐富度則差異不明顯。

圖2 電子舌PPCCAAFig. 2 Principal component analysis based on electronic tongue data

如圖2A所示，PC1和PC2的總貢獻率接近100%，說明電子舌PCA法適用于煙熏液的滋味評價。從圖2B可以看出，7 個煙熏液樣品分布較散亂，其中C-10-03和C-10-10位于PC1左側，而I號、II號、II-2002、II-2003、C-10-05煙熏液位于PC2右側，說明PC1對其具有較好的區分效果；I號煙熏液在PC2上距離II號、II-2002、II-2003、C-10-05煙熏液較遠，所以PC2對其也具有一定的區分效果。結合圖2A，C-10-03和C-10-10兩種類型的煙熏液主要受咸味影響，剩余5 種煙熏液主要是受鮮味、苦味和澀味及豐富度的影響，其中I號煙熏液同時受到酸味的影響。

2.3 GC-MS測定結果

表3 不同類型煙熏風味化合物的GC-MS鑒定結果Table 3 Results of GC-MS Identification of different smoke liquid compounds

續表3

酚類化合物是煙熏肉制品典型的特征風味物質，是重要的調味和芳香化合物，同時也被認為具有抗氧化和抗菌活性[18]。食品熏制過程中所吸附的酚類化合物，是造成煙熏產品獨特香氣主要原因[19]。它們可以由木質素熱降解產生，也可以通過纖維素和半纖維素的熱降解得到[20]。有研究表明，酚類閾值較低，對煙熏干腌火腿的風味影響較大[21]。從表3可以看出，含量較高的苯酚（79.54～6 170.86 mg/L），愈創木酚（79.98～4 049.56 mg/L）、2,6-二甲氧基苯酚（16.81～2 368.71 mg/L）、鄰甲酚（22.21～2 408.02 mg/L）、對甲酚（1 7.2 7～2 4 2 4.5 6 m g/L）、間甲酚（25.14～1 648.79 mg/L）等存在于多種煙熏液中（C-10-22煙熏液除外），這與Montazeri等[22]研究結果相似，它們是典型的煙熏液風味化合物。還有研究報道，愈創木酚及其衍生物的總含量與苯酚、甲酚和二甲苯酚的總含量的相對比率可能對木煙中的香氣產生相當大的影響，而對甲酚、鄰甲酚是典型煙熏液風味的重要貢獻者[23]。Kostyra等[24]研究發現，2,6-二甲氧基苯酚及其衍生物通常與新鮮煙熏食品中檢測到的異味沒有太大關聯。值得注意的是煙熏液C-10-22，其酚類物質僅檢測到苯酚，其質量濃度為79.54 mg/L，均低于其余8 種煙熏液中的苯酚化合物含量。而丁香酚僅存在于C-10-10中，質量濃度為103.47 mg/L。從圖3可知，酚類化合物含量由高到低為C-10-05＞C-10-10＞C-10-11＞II號＞C-10-22＞C-10-03＞II-2002＞I號＞II-2003，其中C-10-05總含量高出II-2003約187 倍?？傮w上看，紅箭煙熏液中酚類化合物含量，明顯優于山楂核煙熏液。

羰基化合物有助于形成木材煙霧的整體感官特性，它們是通過纖維素和半纖維素的熱分解和重新排列而成[25]。含羰基的化合物散發出焦甜的香氣，可軟化與酚類化合物相關的濃煙熏味，并帶有典型的煙熏香氣和風味[26]。如1-羥基-2-丁酮的形成發生在木材半纖維素的低溫熱解過程中[27]，其香氣感帶有甜味、類似咖啡和谷物的氣味[28]；2-環戊烯酮及其衍生物通常存在于木材或煙霧中，其感官特征為難聞苦味，帶有草味，對煙味有影響[29]。羰基化合物是醛、酮、羧酸類化合物的合稱，其中醛酮類化合物被認為在結構、顏色和香氣的發育過程中具有重要的影響，在質地和顏色的形成中所起的作用與食物蛋白質的胺類反應有關，類似于美拉德反應[30]，如具有脂肪香味的糠醛可作為美拉德反應的特征產物，其具有苦杏仁氣味[31]。從表3可以看出，在測定的煙熏液樣品中（C-10-22除外），酮類化合物的數量較豐富，質量濃度較高的有羥基丙酮（49.02～18 971.58 mg/L）、2,3-二甲基-2-環戊烯酮（15.67～444.39 mg/L）、甲基環戊烯醇酮（26.42～459.99 mg/L）、1-羥基-2-丁酮（14.33～1 542.40 mg/L）、2-環戊烯酮（13.91～613.80 mg/L）；而醛類化合物中，5-甲基呋喃醛（10.66～630.68 mg/L）、糠醛（43.59～9 891.82 mg/L）質量濃度較高；在其含量相對較低的風味化合物中，苯基丙酮、環己酮僅在I號和II號煙熏液中檢測到，3-糠醛僅存在于C-10-10中，質量濃度為326.29 mg/L。而對于C-10-22煙熏液，酮類化合物僅檢測到2-十一酮，質量濃度為130.88 mg/L，醛類化合物檢測到壬醛（213.0 mg/L）和2-十一烯醛（265.17 mg/L）。從圖3可知，醛酮類化合物總含量由高到低為C-10-05＞C-10-10＞C-10-03＞C-10-11＞II號＞II-2002＞I號＞C-10-22＞II-2003，其中C-10-05總含量高出II-2003約83 倍?？傮w上看，紅箭煙熏液中醛酮類化合物總含量，明顯優于山楂核煙熏液。

有機酸是木質纖維素和半纖維素的部分熱解產物[32]。在熏制過程中，一系列有機酸可能會沉積在產品表面，因其對食品的風味（酸味）、顏色、質地和微生物的影響而聞名[33]。對于煙熏液來說，酸類主要是作為防腐劑和pH值控制劑存在，因為其揮發性較小，呈香性相對較差且對香氣的貢獻較低，但其含量的高低也可在一定程度上影響食品的保存。從表3可以看出，在測定的煙熏液樣品中，質量濃度較高的有丁酸（36.32～1 971.72 mg/L）、醋酸（1 0 0.2 9～1 9 1 9 1.1 4 m g/L）和丙酸（33.17～1 194.45 mg/L）等。而庚酸（547.74 mg/L）、正壬酸（400.34 mg/L）、辛酸（323.32 mg/L）、己酸（420.79 mg/L）、正癸酸（2 493.34 mg/L）這幾種酸類化合物質量濃度較高僅存于煙熏液C-10-22中，且均為強香氣載體。而醋酸和丙酸的氣味帶刺激性，均可引起煙熏液整體氣味的變化。從圖3可以看出，酸類化合物總含量由高到低為C-10-10＞C-10-05＞C-10-03＞C-10-22＞C-10-11＞II號＞I號＞II-2002＞II-2003。

煙熏食品的感官屬性與熏制過程中酚類、醛類、和酮類有關。除此之外，還有很多次要成分也有著至關重要的作用，如醇類化合物對肉制品風味的影響不如醛類化合物顯著，但對整體氣味有協同作用；酯類化合物主要賦予食品果味和甜味[34]。它們是廣泛使用的香料，常作為主香劑和輔助劑使用，但由于兩者在煙熏液中的含量較低，閾值高且容易揮發，因此在一定程度上是作為煙熏液中重要的風味調和物的存在。由表3可以看出，紅箭煙熏液C-10-03中含1,2-丙二醇質量濃度較高（19 618.53 mg/L），在其他8 種煙熏液中沒有檢測出該化合物；同樣地，1,2-乙二醇單乙酸酯（1 525.31 mg/L）大量存在于C-10-05中；對于油溶性煙熏液C-10-11和C-10-22，測定出質量濃度較高的甘油，分別為7 012.01 mg/L和193.06 mg/L，且在其他幾種煙熏液中未檢測出；另外，在山楂核煙熏液中檢測出吡啶、吡嗪、吡咯及其衍生物，它們均屬于雜環含氮化合物，主要是由于木材含有氮源，其中吡嗪類化合物主要提供烤香、堅果香等風味，可對肉制品的煙熏風味起修飾作用[35]，5 種紅箭煙熏液中均未檢測該類化合物的存在，由于煙熏液中的化合物成分很大程度上取決于煙熏原料的成分以及其制備工藝，因此推測煙熏液在熏材選擇和制備工藝上存在差異。還有其他類化合物，它們相互補充共同組成了整個煙熏液風味的輪廓，在煙熏液中扮演著不可或缺的角色。

為了可視化4 種山楂核煙熏液風味物質的組成，根據表3的測定結果進行維恩圖分析，如圖4所示。4 種山楂核煙熏液樣品成分中共檢測到88 種風味物質，其中52 種為共有化合物，主要包含酮類20 種以及酚類11 種，酸類7 種，醛類2 種，醇類5 種，酯類5 種其他類2 種化合物。在I號、II號、II-2002、II-2003中分別鑒定出11、8、4 種和13 種不同的風味化合物，II-2003煙熏液中異于其他3 種煙熏液的化合物最多，推測這些化合物的分布差異可能與煙熏液的形成過程有關。

圖3 不同類型煙熏液各種類化合物含量Fig. 3 Contents of different classes of flavor components in liquid smokes

圖4 4 種煙熏液不同化合物維恩圖Fig. 4 Venn diagram showing unique and shared flavor compounds in four hawthorn kernel liquid smokes

2.4 煙熏液風味物質PCA

表4 主成分的特征值及其方差貢獻率Table 4 Eigenvalues, contributions and cumulative contributions to total variance of principal components

主成分的數目可以根據相關系數矩陣的特征值判定[36]，對9 種煙熏液中的風味物質種類進行PCA。從表4可以看出，前3 個主成分包含了94.311%的信息。因此取前3 個主成分能夠很好地說明9 種煙熏液風味物質的變化趨勢。各主成分在各因子變量上的載荷值代表該主成分對該因子所能反映的程度[37]。

表5 9 種煙熏液風味物質主成分特征向量及其載荷矩陣Table 5 Principal component eigenvectors and loading matrix

如表5所示，酮類、酚類、醛類與PC1高度正相關；PC2中載荷值最高的正相關風味物質為醇類化合物；PC3中載荷值影響最高的為其他類化合物，上述結果說明酮類、酚類、醛類、醇類和酯類化合物為這9 種煙熏液中含量發生顯著變化的風味物質。

2.5 煙熏液樣品中風味物質品質評價模型的建立

將得到的特征向量與標準化后的數據相乘得出9 種紅箭煙熏液化合物主成分的線性關系式如下：

其中X1～X8為原始變量標準化后的值，Z1、Z2、Z3表示3 個主成分的得分值，得分值相對越大，品質越好。

表6 標準化后主成分綜合得分Table 6 Synthetic scores of principal components after standardization

根據特征向量與標準化后的數據相乘求和，再與對應的3 個主成分方差貢獻率做內積，得到綜合風味品質的評價函數Z，其表達式Z=0.637 12Z1+0.181 56Z2+0.124 43Z3。從表6可以看出，PC1得分最高的是C-10-05煙熏液，其次是C-10-10煙熏液，這2 種煙熏液主要是受PC1的影響，結合表5可知，酮類、酚類以及醛類物質對這2 種煙熏液的影響較高，因此它們可能共同決定了這2 種煙熏液的風味特征。PC2得分最高的是C-10-03煙熏液，因此醇類化合物可能決定了該煙熏液的風味特征；PC3得分最高的是C-10-05煙熏液，受到其他類化合物的影響。在風味品質綜合排名中可以更加直觀地看出，9 種不同類型煙熏液中風味物質強度綜合得分從高到低順序依次為C-10-05、C-10-10、C-10-03、C-10-11、C-10-22、II號、II-2002、I號、II-2003煙熏液，從該模型排序得出5 種紅箭牌煙熏液的風味優于4 種山楂核煙熏液的風味。

3 結 論

采用電子鼻技術發現4 種山楂核煙熏液在風味上有一定的相似性，這與維恩圖分析的結果相映證；而5 種紅箭煙熏液的風味存在差異，推測是煙熏液提取方法的不同而引起其中某些化合物的變化。電子舌結合PCA發現7 種類型煙熏液（油溶性煙熏液除外）的滋味品質整體結構存在差異，C-10-03和C-10-10主要受咸味影響，剩余5 種煙熏液主要是受咸味、苦味和澀味及豐富度的影響，其中I號煙熏液同時受到酸味的影響。GC-MS結果共檢測出156 種風味物質，僅苯酚為共有風味物質，說明煙熏液在風味組成上存在較大差異，其中酮類、酚類、醛類、酸類化合物在含量上具有較大優勢，如羥基丙酮、2,3-二甲基-2-環戊烯酮、甲基環戊烯醇酮、1-羥基-2-丁酮、2-環戊烯酮、5-甲基呋喃醛、糠醛、苯酚、愈創木酚、2,6-二甲氧基苯酚、鄰甲酚、對甲酚、間甲酚、丁酸、醋酸和丙酸等含量較高且存在于多種煙熏液中（C-10-22煙熏液除外）；值得注意的是含氮類化合物如吡嗪、吡咯、吡啶等化合物及其衍生物在紅箭煙熏液中未檢測出，推測是由于熏材原料不同而導致的差異；還有質量濃度較高的1,2-丙二醇、1,2-乙二醇單乙酸酯分別存在于C-10-03、C-10-05中，對于油溶性煙熏液C-10-11和C-10-22，測定出質量濃度較大的甘油，且在其他幾種煙熏液中未檢測出，推測是提取過程的添加物。最后從煙熏液風味物質品質綜合評價模型可知，山楂核煙熏液的風味物質相較于紅箭煙熏液弱。

綜上所述，電子鼻可以從香氣上感知不同類型煙熏液的差異，而GC-MS結果可在一定程度上解釋該差異來源，電子舌則作為滋味補充，三者從整體上相互映證、相互補充，為分析不同類型煙熏液提供了理論依據和技術參考。