美洲大蠊提取物CⅡ-3的抗肝癌譜效關系研究

周姣姣 何正春 夏從龍 張成桂 劉湘 劉光明

摘 要 目的：研究美洲大蠊提取物CⅡ-3與其體外抗肝癌活性的譜效關系，并初步明確其抗肝癌活性成分。方法：在已建立10批CⅡ-3樣品的超高效液相色譜（UHPLC）指紋圖譜的基礎上，借助超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用法（UHPLC-Q-TOF/MS），通過標準品和相關文獻定性鑒定各色譜峰對應的化合物;以各批CⅡ-3樣品對人肝癌細胞HepG2的半數抑制濃度（IC50）為抗肝癌活性指標，采用灰色關聯度分析法（GRA）與正交偏最小二乘法（OPLS）建立并分析指紋圖譜與抗肝癌活性之間的譜效關系。結果：10批CⅡ-3樣品的UHPLC指紋譜圖中有共有峰25個，指認出其中10個，分別為環（酪氨酸-脯氨酸）（峰24）、環（甘氨酸-苯丙氨酸）（峰15）、次黃嘌呤（峰3）、腺嘌呤（峰7）、苯丙氨酸（峰10）、肌苷（峰11）、N-乙酰多巴胺（峰16）、環（脯氨酸-丙氨酸）（峰13）、2-羥基馬尿酸（峰22）、環（脯氨酸-絲氨酸）（峰6）。10批CⅡ-3樣品對HepG2細胞的IC50為70.550～200.303 μg/mL。25個共有峰中，以抗肝癌活性的GRA分析關聯度（r）排序為峰20>23>24>15，且其r值均大于0.7;以OPLS分析變量重要性投影（VIP）值排序為峰23>18>15>24>7>14>6>2>20，且VIP值均大于1，其中峰7、15、20、23、24的標準回歸系數均大于0，峰2、6、14、18的標準回歸系數均小于0。聯合分析顯示，CⅡ-3樣品抗肝癌活性主要成分依次為峰20>23>24>15。結論：CⅡ-3中兩個未知化合物（峰20、23）和環（酪氨酸-脯氨酸）（峰24）、環（甘氨酸-苯丙氨酸）（峰15）可能是其抗肝癌活性的主要成分。

關鍵詞 美洲大蠊;抗肝癌作用;灰色關聯度法;正交偏最小二乘法;譜效關系;超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用法

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the spectrum-effect relationship of anti-hepatoma effect of CⅡ-3 extract from Periplaneta americana， and to preliminarily clarify the anti-hepatoma active components of it. METHODS： Based on UHPLC fingerprints of 10 batches of CⅡ-3 samples， with the help of UHPLC-Q-TOF/MS， the compounds corresponding to each chromatographic? peak were identified qualitatively by standard substances and related literatures. Using the IC50 value of each batch of CⅡ-3 sample against human hepatoma cells HepG2 as anti-hepatoma activity index， the spectrum-effect relationship of fingerprint and anti-hepatoma effect was established and analyzed by the combination of grey relational analysis （GRA） and orthogonal partial least squares （OPLS）.? RESULTS： There were 25 common peaks in UHPLC fingerprints of 10 batches of? ? CⅡ-3 samples， and 10 chemical compounds were identified， which were cyclo-（Tyr-Pro） （peak 24），cyclo-（Gly-Phe） （peak 15），hypoxanthine （peak 3），adenine （peak 7），phenylalanine （peak 10），inosine （peak 11），N-acetyldopamine （peak 16），cyclo-（Pro-Ala） （peak 13），2-hydroxy propionyl （peak 22），cyclo-（Pro-Ser） （peak 6）. The IC50 of 10 batches of CⅡ-3 samples to HepG2 cells was 70.550-200.303 μg/mL. Among 25 common peaks， the order of GRA correlation （r） of anti-hepatoma activity was peak 20>23>24>15， all of r values were greater than 0.7; the order of variable importance projection （VIP） of OPLS analysis was peak 23>18>15>24>7>14>6>2>20， all of VIP values were greater than 1. The standard regression coefficients of peak 7， 15， 20， 23， 24 were all greater than 0; while the standard regression coefficients of peak 2， 6， 14， 18 were all less than 0. Conjoint analysis shows that the order of anti-hepatoma activity was peak 20>23>24>15. CONCLUSIONS： unknown chemical ingredients（peak 20， 23），cyclo-（Tyr-Pro）（peak 24） and cyclo-（Gly-Phe）（peak 15） in CⅡ-3 may be main anti-hepatoma active components.

KEYWORDS? ?Periplaneta american; Anti-hepatoma effect; Grey relational analysis;? Orthogonal partial least squares; Spectrum-effect relationship; UHPLC-Q-TOF/MS

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）為蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱蟑螂。其藥用歷史悠久，始載于《神農本草經》，主治“小兒疽積、癥瘕積聚和瘡癰腫毒”[1]。近年來，美洲大蠊的藥用價值得到學者的廣泛認同，大量研究表明其具有明顯的促進組織修復再生、抗氧化、抗腫瘤、抗肝炎和免疫調節等功效[2-5]。本課題組前期研究表明，以美洲大蠊提取物CⅡ-3為原料的美蠊精膠囊具有顯著的抗肝癌作用[6-7]，并建立了10批CⅡ-3樣品的指紋圖譜[8]。但其抗肝癌的活性成分尚未明確，且缺乏藥效物質基礎方面的相關研究。為此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用法（UHPLC-Q-TOF/MS），通過標準品比對和文獻檢索對CⅡ-3所含化合物進行分析鑒定;以CⅡ-3對人肝癌細胞HepG2的半抑制濃度（IC50）為抗肝癌活性指標，采用灰色關聯度分析法（GRA）和正交偏最小二乘法（OPLS）聯合建立指紋圖譜與抗肝癌活性之間的譜效關系，旨在為美洲大蠊提取物CⅡ-3的抗肝癌物質基礎研究和臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UITiMate 3000型UHPLC儀（美國Thermo? Fisher Scientific公司）;MALDI-TOF MS系統（德國Bruker公司）;FDU-2100型冷凍干燥機（昆明倍捷科技有限公司）;SB25-12D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];NU-5510E 型CO2培養箱（美國NuAire公司）;SN255939型酶標儀（美國BioTek公司）;DT5-6型臺式低速離心機（北京時代北利離心機有限公司）;DW-86L388型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）;ES-315型高壓滅菌鍋（日本Tomy Digital Biology公司）;WTE-PW8-5012型超級純水機（格力電器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

美洲大蠊提取物CⅡ-3由大理大學藥化學院劉光明教授提供（編號：S1～S10，每克CⅡ-3樣品相當于100 g干燥的美洲大蠊）;肌苷標準品和次黃嘌呤標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：NUAD-SQW2、B96L-VFAP，純度均大于98%）;DMEM培養基和胎牛血清（美國Gibco公司）;噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司;磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，天津市福晨化學試劑廠）;乙腈（德國Merck公司，色譜純）;其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 細胞

人肝癌HepG2細胞株由齊氏生物科技有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 CⅡ-3樣品體外抗肝癌試驗

2.1.1 樣品制備 分別精密稱取10批CⅡ-3樣品各6.00 mg，溶于含10%胎牛血清的DMEM培養基（以下簡稱“完全培養基”）10 mL中，得到質量濃度為600.00 ?g/mL的母液，再用完全培養基稀釋成400.00、300.00、200.00、100.00、50.00 ?g/mL等5個質量濃度的CⅡ-3溶液，備用。

2.1.2 細胞培養 用完全培養基于37 ℃、5%CO2培養箱中培養HepG2細胞（培養條件下同）。培養過程中，1～2 d換一次細胞培養液，3～4 d傳一代細胞。

2.1.3 CⅡ-3樣品對肝癌HepG2細胞活性的影響 取對數生長期HepG2細胞，用完全培養基調整細胞密度至1×105 個/mL，按100 ?L/孔接種至96孔板中，培養24 h后，吸出培養液，PBS清洗2次，加入“2.1.1”項下5個質量濃度的CⅡ-3溶液（給藥濃度依據前期試驗設置），同時設置空白對照組（不含細胞、不含藥物）和溶劑對照組（不含藥物、只含細胞），每組設5個復孔。給藥后繼續培養72 h，吸棄孔內培養液，PBS清洗2次，再加入MTT溶液20 ?L，輕輕拍勻，繼續培養4 h后，每孔添加DMSO 150 ?L，低速振蕩10 min，使用酶標儀在490 nm波長下檢測各孔的吸光度。每組試驗重復3次，取平均值，計算CⅡ-3樣品對HepG2細胞的抑制率：細胞抑制率（%）=（溶劑對照組吸光度-給藥組吸光度）/（溶劑對照組吸光度-空白對照組吸光度）×100%。

2.1.4 統計學分析 采用Excel 2003進行線性回歸分析，通過回歸方程預測10批CⅡ-3樣品對HepG2細胞的半數抑制濃度（IC50），結果見表1。結果顯示，各批CⅡ-3樣品對HepG2細胞的IC50為70.550～200.303 μg/mL。

2.2 CⅡ-3樣品的化學成分分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18 110A（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0.0～11.0 min，1.0%A→3.5%A;11.0～37.3 min，3.5%A→8.0%A;37.3～90.0 min，8.0%A→22.0%A;90.0～104.0 min，22.0%A→28.0%A;流速：0.5 mL/min;柱溫：28 ℃;檢測波長：214 nm;進樣量：8 ?L。

2.2.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI）以正、負離子兩種模式分別進行檢測;掃描范圍：m/z 50～1 200，以甲酸鈉進行質量實時矯正;噴霧氣體和干燥氣體均為高純度氮氣;碰撞氣體：氬氣;離子噴霧電壓：4 500 V;檢測電壓：2 000 V;脫溶劑氣溫度：180 ℃;錐孔氣流量：8.0 mL/min;離子源溫度：200 ℃。

2.2.3 UHPLC指紋圖譜生成和共有峰指認 按本課題組前期已建立的指紋圖譜研究方法，按“2.2.1”項下色譜條件對10批CⅡ-3樣品的指紋圖譜進行分析。相關方法學考察內容見已發表文獻[8]。10批CⅡ-3樣品的UHPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜見圖1，CⅡ-3樣品在正、負離子模式下的基峰離子流圖見圖2。根據標準品和相關文獻[9-15]定性鑒定出10個化合物，結果見表2。從圖1和表2可知，CⅡ-3的指紋圖譜中有25個共有峰，其中峰7、10、11、15分別為腺嘌呤、苯丙氨酸、肌苷、環（甘氨酸-苯丙氨酸），由于其峰面積相對較大，推測均為CⅡ-3樣品的主要成分。

2.3 CⅡ-3樣品譜效關系的建立

2.3.1 GRA 以UHPLC指紋圖譜的共有峰峰面積為比較序列，以CⅡ-3樣品對HepG2細胞的IC50為參考序列，采用均值化法對上述序列數據進行無量綱化處理;數據經處理后，比較序列記為{Xi（m）}，參考序列記為{X0（m）}，計算關聯度（r）。r值越大，表明該色譜峰對藥理活性影響越大[16]。CⅡ-3的25個共有峰中，以r值排序，峰20、23、24、15對CⅡ-3樣品的抗肝癌活性貢獻較大，r均大于0.7;峰21、17、3、7、10、1、11、16、13、19、25、8、9、22的貢獻次之，r大于0.6且小于0.7;峰5、14、2、4、12、6、18的貢獻較小，r均小于0.6，詳見表3。

2.3.2 OPLS分析 以UHPLC指紋圖譜的共有峰峰面積為自變量，以CⅡ-3樣品對HepG2細胞的IC50為因變量，將峰面積做歸一化處理后導入Simca 13.0軟件中，計算25個共有峰與IC50（藥效）的標準化回歸系數和變量重要性投影（VIP），結果見圖3。

由圖3B可知，以VIP值排序，峰23、18、15、24、7、14、6、2、20的VIP值均大于1，說明這些峰對CⅡ-3樣品的抗肝癌活性有重要影響。結合圖3A可知，在VIP大于1的色譜峰中，峰23、15、24、7、20的標準化回歸系數大于0，其與CⅡ-3樣品的抗肝癌活性成正相關，峰18、14、6、2的標準化回歸系數小于0，兩者成負相關。

2.3.3 GRA和OPLS的聯合分析 將r>0.7和VIP>1的峰整合，發現CⅡ-3樣品抗肝癌活性的主要成分依次為峰20（未知化合物）>23（未知化合物）>24[環（酪氨酸-脯氨酸）]>15[環（甘氨酸-苯丙氨酸）]，且均與藥理活性成正相關。

3 討論

有研究表明，以美洲大蠊為原料制得的美蠊精膠囊等藥品的藥理活性顯著且臨床應用廣泛[7-8]，但其化學成分研究較為薄弱，尚未找到特異性的活性物質，亦無其真正發揮臨床療效活性物質的相關報道?；诖?，本課題組結合前期UHPLC指紋圖譜，采用UHPLC-Q-TOF/MS技術在正、負離子模式下對10批美洲大蠊提取物CⅡ-3進行整體分析，共得25個共有峰并鑒定出10個化合物，多為環二肽類和核苷類成分。據報道，環二肽類是具有抗癌、抑菌、抗凝和抗氧化等作用的一類活性物質[17-19]，核苷類物質多具有抗病毒、抗腫瘤和肝損傷修復等作用[20]?？梢?，美洲大蠊提取物CⅡ-3的抗肝癌作用可能與這兩類物質緊密相關。

GRA法常用于預測中藥或復方中各成分與藥效的相關性，具有對樣本容量和數據分布規律要求低、計算簡便且易程序化的特點[21]。但該方法計算出的關聯度只具有相對意義，只能反映化合物與藥效間相關性的大小，不能判斷出正負關聯，而OPLS法則可彌補GRA法的這一不足[22]。因此，本研究采用兩種方法聯合分析CⅡ-3與抗肝癌活性之間的譜效關系。結果表明，25個共有峰中有18個特征峰與CⅡ-3樣品抗肝癌活性的r值大于0.6，證明其具有相關性。但所有峰的r值均未超過0.8，表明其相關性不顯著。其中，峰20、23、24、15的r值大于0.7、VIP值大于1且標準化回歸系數均大于0，說明其對藥效貢獻相對較大并成正相關。曾瑤波等[23]研究表明，環（酪氨酸-脯氨酸）（峰24）有良好的抗肝癌活性，可能是CⅡ-3抗肝癌的活性成分。

綜上所述，本研究通過譜效分析初步闡明了美洲大蠊提取物CⅡ-3體外抗肝癌的活性物質，為該藥的物質基礎研究和臨床應用提供了實驗依據，亦為以美洲大蠊為原料的相關藥品或有效部位的化學成分及作用機制的進一步研究提供了參考。

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（收稿日期：2020-04-04 修回日期：2020-07-03）

（編輯：鄒麗娟）