核桃肽提高SAMP8小鼠生存質量和壽命的研究

樊蕊 杜倩 郝云濤 徐美虹 李勇

摘 要：目的：評估核桃肽對衰老和老齡小鼠生存質量和壽命的改善作用。方法：取60只SAMP8小鼠隨機分為4組，包括模型對照組和低、中、高劑量3個核桃肽干預組，另設SAMR1小鼠作為正常對照組。通過攝食量、飲水量、體重的變化，以及體脂含量、代謝率、臟器指數，評估其生存質量的改善;通過衰老評分表征其衰老特征和程度;通過壽命分析，表征核桃肽對SAM小鼠壽命的影響。結果：模型對照組小鼠體重、肌肉率均低于正常對照組和各劑量干預組，低劑量干預組腓腸肌質量、呼吸商和代謝率均顯著高于模型對照組（P<0.05）。低劑量組生存率和壽命大于模型對照組。結論：低劑量核桃肽緩解SAMP8小鼠衰老、提高生存質量、延長其壽命的效果較明顯。本研究對核桃肽延緩衰老的深入研究提供了科學依據。

關鍵詞：SAMP8;衰老;壽命;生存質量;核桃肽

快速老化小鼠SAM是日本京都大學Takeda教授經過20多年精心培育得到的一種近交系衰老模型鼠，包括SAMP（SAMP）和SAMR（SAMR）兩種品系[1]。SAMP在進入成熟期（約4～6月齡）后迅速出現行動反應遲緩、被毛光澤減退、脫毛、皮膚潰瘍、眼周損害、角膜潰瘍、白內障、脊柱彎曲等老化特征，P8是SAMP系中的一個亞系，主要以學習記憶能力障礙為老化特征，其壽命約為12.1個月，是目前比較理想的自然衰老模型小鼠 [2-3]。

目前對于核桃的加工與利用主要是核桃油的加工，但其剩余的核桃粕仍然含有大量的蛋白質，其蛋白質氨基酸組成合理，具有極高的營養價值。利用現代生物酶解技術，對核桃蛋白質進行水解，進一步分離純化，制備而來的核桃肽（WP），具有高吸收、高活性且安全性高的優點，具有廣闊的開發前景和應用價值。實驗證實，WP具有顯著的抗氧化活性[4-5]，能夠提高小鼠體內的 SOD 和 GSH-Px，同時降低小鼠體內MDA含量[6]。同時，核桃多肽可以降低D-半乳糖誘導老年小鼠血脂水平[7]。目前對WP的研究多集中在其抗氧化等生理活性方面，而對于衰老的機制其中包活氧化應激理論研究較少。因此，對于WP對衰老的影響研究勢在必行。本研究就WP對SAMP8小鼠衰老進程以及生存質量的影響予以探析，以期揭示WP改善增齡帶來的生存質量的下降，為衰老的營養干預提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

WP：淡黃色固體粉末，主要成分為分子量小于1 000的小分子低聚肽，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量較多，由北京天肽生物科技有限公司提供。

1.2 實驗動物及飼養條件

4月齡SPF級雄性SAMP8小鼠60只，相同月齡的SAMR1小鼠20只，由北京大學醫學部實驗動物中心提供[動物合格證號：SCXK（京）2011- 0012]，SPF級動物房，單籠飼養，飼養環境溫度21～23 ℃，濕度50%～60%。喂飼普通小鼠生長飼料，所有動物自由飲水進食。動物喂養及實驗嚴格按照《北京市實驗動物管理條例》執行，并經過北京大學醫學部倫理委員會審核通過（批準號：LA2017017）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和飼養 小鼠適應性喂養1周，按照體重隨機分為4組，即SAMP8模型對照組，WP低、中、高劑量干預組[WP（A）、WP（B）、WP（C）]。同時采用同月齡SAMR1小鼠作為正常對照組。對照組給予普通飲水，WP干預組分別給予低、中、高濃度WP（濃度依次為110、220、440 mg/kg·BW），均隨飲水攝入。所有動物均自由飲水進食，并記錄每日飲水量、進食量及體重變化。

1.3.2 動物一般狀態觀察及體格指標測定 每周觀測并記錄動物的活動度、毛發光澤、攝食量、飲水量、體重。

1.3.3 臟器指數 各組小鼠飼養臨近至壽命終點時，小鼠稱重后脫頸椎處死，無菌快速剝離腓腸肌及其他肌肉，記錄腓腸肌質量、其他肌肉質量。分別取并稱重小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺，計算臟器指數。臟器指數=臟器重（g）/體重（kg）

1.3.4 爬網實驗 分別在小鼠70周齡時，將小鼠放在垂直的金屬網上，金屬網（長度1.5 m、寬度0.5 m）置于距地面0.5 m處，記錄每只小鼠在金屬網上停留時間。

1.3.5 老化度評分 采用日本京都大學竹田俊男和細川昌則教授制定的老化度評分標準[8]適當修改，分別將小鼠外在形體及行為的老化改變從外觀衰老（光澤及粗糙程度、脫毛程度）、組織病變（皮膚潰病、眼周損害、白內障、陰莖、腫瘤、斷尾）、體態衰老（脊柱后凸、顫抖）、反應遲鈍（反應性、被動逃避）等12項進行綜合評價，再根據嚴重程度不同，將每項指標標定分值，客觀進行評分，分值越高則老化度越高。

1.3.6 呼吸代謝 取70周齡的各組小鼠放在TSE LabMaster 呼吸代謝分析系統的樹脂檢測籠內，每個檢測籠每次只放1只，測前稱定小鼠體質量，供應新鮮的空氣保持室內充分干燥，濕度不超過70%，室溫控制在20～25 ℃，實驗人員不能頻繁地進出房間，以免影響測量的準確性，采樣流速持續控制在0.80 L/min。測定結束后，計算呼吸商（RER）和產熱。RER是單位時間內的二氧化碳的產量與耗氧量之比：RER=VCO2/VO2，其中VCO2是指單位時間內與參比籠相比，測試籠產生的二氧化碳的量;VO2是測試籠消耗氧氣的量，是反映機體能量代謝的重要指標，根據TSE LabMaster 呼吸代謝分析系統計算參數[9]，呼吸代謝作為反映能量代謝特征最直接的指標，與機體的功能調節有著非常密切的關系。

1.3.7 體脂成分測定 將70周齡的小鼠稱重后，放置在相應型號的透明塑料動物艙內，動物艙插入Echo MR ITM（上海匯佳生物科技有限公司）內，掃描得到小鼠的肌肉和脂肪含量。

1.4 統計分析

所有數據應用SPSS統計軟件進行分析，結果以±s表示，采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異法（LSD），P<0.05為統計檢驗界值。用SPSS 18.0對小鼠生存狀態進行壽命表和Kaplan-Meier分析。

2 結果與分析

2.1 各組SAM小鼠體重變化

由圖1可以看出，隨著SAM小鼠周齡的增加，其體重呈現先增加后降低的趨勢，各組小鼠體重的變化大體趨勢相似，但是在整個生命周期中，模型對照組小鼠整體體重均低于正常對照組和各干預組。整個生命周期，小鼠體重經歷了增長期Ⅰ、降低期Ⅰ、增長期Ⅱ和降低期Ⅱ。各組小鼠體重變化期間的差別主要集中在體重增長期Ⅰ，即正常對照組小鼠在17～33周齡時，體重呈現曲折增加的趨勢，而模型對照組小鼠體重則在17～45周之間呈現曲折增加的趨勢，但低、高劑量干預組SAMP8小鼠體重增長期Ⅰ均延長至49周，隨著周齡的增加，之后體重變化時期經歷的時間相同。

由表1可知，各組SAM小鼠肌肉率呈現顯著差別，其中，模型對照組小鼠肌肉率最低，顯著低于正常對照組小鼠和低、高劑量干預組小鼠（P<0.05），而低劑量干預組小鼠肌肉率最高為89%。同時，模型對照組小鼠的脂肪率高于正常對照組和各劑量干預組小鼠，甚至各劑量干預組小鼠的脂肪率低于正常對照組小鼠，但未呈現統計學差異（P>0.05）。模型對照組小鼠RER最低，其顯著低于低劑量干預組小鼠（P<0.05），而各劑量干預組小鼠的代謝率均高于對照組小鼠，但未存在統計學差異（P>0.05），同時，各劑量干預組小鼠產熱均高于對照組小鼠，其中，低劑量干預組小鼠與模型對照組小鼠存在統計學意義（P<0.05）。

2.2 各組SAM小鼠攝食量、飲水量的變化

由圖2可以看出，從整體趨勢看，各劑量干預組小鼠攝食量>模型對照組>正常對照組，且隨著整個生命進程，各組小鼠攝食量呈現降低趨勢。各劑量干預組小鼠攝食量顯著下降期出現在34～45周齡，而正常對照組和模型對照組小鼠攝食量下降期持續更長至54周，在45～70周齡的各劑量干預組小鼠攝食量呈現曲折變化，當正常對照組和模型對照組小鼠經歷了攝食量增加期（54～74周）后，各組小鼠攝食量再一次出現下降的趨勢。從整體趨勢看，在50周前，正常對照組飲水量>模型對照組>各劑量干預組，而隨著周齡增加，模型對照組>各劑量干預組>正常對照組。在17～21周之間，模型對照組和正常對照組小鼠飲水量增加，而后隨著周齡增加，各組小鼠飲水均呈現降低趨勢，直至34

周后，經歷一個短暫的飲水量增加期后，各組飲水量又經歷了急劇下降，在50～55周之間，各組飲水量小幅升高后再一次呈現降低趨勢。

2.3 各組SAM小鼠臟器指數

由表2可知，臨近壽命終點的模型對照組小鼠的肝臟指數、脾指數、腎指數均小于正常對照組和各劑量干預組小鼠，其中正常對照組小鼠的腎臟指數顯著高于模型對照組和各劑量干預組小鼠（P<0.05），模型對照組小鼠的胸腺指數顯著低于中劑量干預組小鼠（P<0.05），但其顯著高于正常對照組和高劑量干預組小鼠（P<0.05）。而各組小鼠的心臟指數并無特征性差異（P>0.05）。

2.4 各組SAM小鼠運動能力和骨骼肌含量比較

由圖3可以看出，臨近壽命終點的模型對照組小鼠的腓腸肌質量均小于正常對照組和各劑量干預組小鼠，其中，模型對照組小鼠的腓腸肌質量顯著低于中劑量干預組小鼠（P<0.05），相似現象也反映在其抓網能力，模型對照組小鼠抓網能力顯著低于各劑量干預組和正常對照組小鼠（P<0.05），同時，雖然各劑量干預組小鼠抓網能力均有改善，但其依然顯著低于正常對照組小鼠（P<0.05）。

2.5 各組SAM小鼠衰老程度評價

從圖4可以看出，70周齡的SAM小鼠衰老表現在外觀衰老、體態衰老、組織病變和反應遲鈍方面，除組織病變方面，各劑量干預組和模型對照組小鼠表現相當，其嚴重程度均高于正常對照組小鼠，其中外觀衰老、體態衰老和反應遲鈍方面的衰老程度，模型對照組均表現為最明顯。在反應方面，各劑量干預組的評分較低，在外觀和組織病變方面，低劑量干預組和正常對照組得分較低?？梢?，低劑量WP緩解SAMP8小鼠衰老的效果較明顯。

2.6 SAM小鼠壽命分析

由表3可以看出，最早出現死亡的為高劑量干預組，當喂養60周時，正常對照組和低劑量、中劑量干預組存活率較高，其中低劑量干預組存活率達到94%，甚至高于正常對照組，當壽命終點時，依然是低劑量存活率最高。

由圖5可知，正常對照組小鼠在55～56周齡時，開始出現死亡，此時段死亡比例為5%，但模型對照組小鼠在34～35周齡時，便開始出現死亡，此時段死亡比例為7%。在整個生命進程中，模型對照組小鼠在40～60周齡之間，其生存率急速下降，而正常對照組小鼠在60～67周齡之間、73～80周齡之間出現兩個死亡率急速上升期。通過WP進行干預后，其衰老進程減緩。低、中、高劑量干預組小鼠分別在40～41周、45～46周、29～30周齡出現死亡，此時段死亡比例分別為6%、7%和6%。且52周齡時，低、中、高劑量干預組累計生存比例分別為94%、88% 、53%，在飼養60周后，低、中、高劑量干預組累計生存比例分別為88%、65%、47%，其中，低劑量干預組生存率遠遠高于模型對照組的生存比例，甚至高于正常對照組的生存比例。由圖5可以看出，低劑量干預組死亡率急劇增加期與正常對照組，同樣發生在70周。通過分析，正常對照組、模型對照組以及低、中、高劑量干預組小鼠的中位數生存時間分別為79、70、74、71、60周。通過生存函數曲線可以看出，模型對照組較正常對照組和低劑量干預組小鼠的生存率下降更快，通過Log Rank （Mantel-Cox）（P<0.05）、Breslow （Generalized Wilcoxon）（P<0.05）、Tarone-Ware（P<0.05）分析，可知正常對照組小鼠以及各劑量干預組的生存率均顯著高于模型對照組小鼠。

3 討論

SAM系小鼠所表現出的特異性與衰老直接相關的病理生物學表型與許多人類老年性疾病的病理改變類似[10-11]。因此，SAMP8小鼠是研究衰老與學習記憶功能障礙作用機制以及探討神經內分泌免疫調節平衡的較理想模型。動物自然衰老時，其體重和體力不斷下降，記憶力逐漸減退，行動變得遲緩。動物體重的下降是由于構成機體的主要物質如蛋白質、核酸、脂肪的代謝率下降，合成量少于分解量，結構物質的不斷損耗，使細胞結構受到破壞，細胞間及細胞質中的水分失去依托也逐漸喪失，因而體重下降。本研究發現，隨著周齡的增加，模型對照組在24周時體重開始出現下降，而WP（A）干預，在51周之前，體重呈現持續增長，表明其有效地延遲了衰老伴隨的體重減輕，并且在整個生命周期，WP各干預組的體重均高于模型對照組，其中WP（A）效果更加顯著。與之對應，整個生命周期，干預組攝食量高于模型對照組，甚至正常對照組小鼠，這在一定程度上表明WP提高了衰老小鼠的生存質量。

從圖3臨近壽命終點的模型對照組小鼠的腓腸肌質量均小于正常對照組和各劑量干預組小鼠，70周齡的模型對照組小鼠抓網能力低于各劑量干預組和正常對照組小鼠。體力的下降是由于骨骼肌中蛋白質合成量不足，細胞結構破壞后氧化磷酸化功能受損，ATP合成減少所致[12]。研究表明，隨著年齡的增長，機體通常會出現脂類代謝紊亂，而這種紊亂可導致體重增加，脂肪含量增加[13]。本研究顯示，各劑量干預組肌肉質量高于模型對照組和正常對照組，腓腸肌含量也高于對照組，而體脂率低于模型對照組和正常對照組。一方面，衰老的程度加深，骨骼肌內自由基積累增多，肌蛋白分解增加，導致骨骼肌組織總蛋白含量的降低，文獻報道，WP具有顯著的抗氧化作用，提高血清中SOD活力，降低MDA含量，從而提高SOD/MDA 比值，降低骨骼肌脂褐素的含量，可以有效提高機體的抗氧化能力，減少自由基的生成，減輕大鼠機體衰老的程度[4-6];另一方面，隨著年齡的增長，骨骼肌蛋白更新率下降，骨骼肌中蛋白質合成減少而分解增加，最終導致衰老機體骨骼肌蛋白含量的減少，而肽的吸收和利用均強于蛋白質，因此，可以補償衰老帶來的負擔平衡。

衰老的免疫學假說認為，免疫功能的衰退是造成機體衰老的重要原因。胸腺和脾是重要的免疫器官，其內臟在一定程度上可以反映一個身體的免疫功能[14]。本研究顯示，通過WP干預，可以提高SAMP8小鼠的胸腺和脾臟臟器指數，這一結論不僅表現在對于衰老小鼠的免疫調節上，對于免疫低下小鼠和正常小鼠補充核桃提取物和WP依然可以提高其免疫器官的臟器指數[6，15]，有利于促進體液免疫和細胞免疫應答提高其免疫力，不少學者通過實驗證實，生物活性肽具有提高免疫的作用，可能的機制為提高小鼠免疫力是通過增強Th細胞功能、促進體內抗體生成以及抑制Tr細胞功能而實現的[16-17]。

文獻報道，SAMP8平均生存期限為12～13個月，4～6月齡后開始出現衰老征象，故9月齡已進入老化階段[18]。通過WP進行干預后，其衰老進程減緩。低劑量干預組生存比例遠遠高于模型對照組，甚至高于正常對照組。SAMR1、SAMP8對照組小鼠以及低、中劑量干預組小鼠和正常對照組的中位數生存時間均高于模型對照組。低、中劑量干預組的生存率均顯著高于模型對照組小鼠。有文獻報道，二甲雙胍對延長SAMP8雄性小鼠的壽命起到積極的作用。通過中劑量組二甲雙胍干預的SAMP8小鼠12月齡生存率達到70%[19-20]，而本研究發現，經過低劑量WP干預，自然生長的SAMP8小鼠12月齡的生存比例為均大于90%。日本兩項研究表明，SAMP8小鼠攝入1975年的日本膳食模式，可以顯著延長其壽命，其周齡80周時，其生存率為22%。此生存率與本研究中低劑量WP干預的SAMP8小鼠壽命相當[21]。在膳食中加入葵花籽油和魚油，雖然可以小幅度的延長SAMP8壽命（中位數生存時間分別為葵花籽油56周、魚油48周），但其效果并沒有WP顯著[22]。

實驗證實，機體對于衰老的調節，可以通過多種通路（AMPK 通路[23-24]、Nrf2/ARE信號通路[25]、RhoA/Rho激酶通路[26]）共同進行，降低氧化應激，可以調節以上通路中的因子[27-28]。推測WP延緩SAMP8小鼠衰老的機制部分源于其抗氧化性[4-5]。對于WP延緩衰老的機制將在后續研究中予以探索?！?/p>

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Abstract：Objective ? To evaluate the effect of walnut peptide（WP）on improving the life quality and life span of SAMP8.Method ? Totally 60 SAMP8 were randomly divided into 4 groups including the model control group，low，middle and high-dose WP intervention group，and the senescence accelerated resistant mouse （SAMR 1）were the normal control group.The improving in the life quality during the life cycle of SAM series mice was evaluated by the food intake，water intake，body weight，body fat content，metabolic rate and organ index.The aging characteristics and degree were characterized by the aging scores，and the effect on the life span was investigated by life span analysisResult ? The weight and muscle rate of the model control group were lower than those in the normal control group and each intervention group，and the gastrocnics muscle mass，respiratory quotient and metabolic rate in the low-dose intervention group were significantly higher than those in the model control group（P<0.05）.The survival rate and life span in the low-dose group were higher than those in the model control group.Conclusion ? The low-dose WP intervention showed the obvious influences of improving the aging，life quality and life span in SAMP8 mouse.This paper provideed scientific evidence for the further study on the anti-aging effect of WP.

Keywords：SAMP8;aging;life span;life quality;walnut peptide（WP）