胡蘿卜1個新4CL基因的克隆、進化及表達分析

羅慶 鐘秀來 盧松

摘要：胡蘿卜（Daucus carota L.）在NCBI（美國國家生物信息中心）上總共公布了13個4-香豆酰-CoA連接酶（4CL）基因，而在芹菜轉錄數據中發現1個4CL基因，利用該基因序列設計1對克隆引物，成功得到1個新胡蘿卜4CL基因，命名為Dc4CL-1。Dc4CL-1基因長1 635 bp，編碼544個氨基酸，位于胡蘿卜基因組第2染色體上。進化樹分析顯示，Dc4CL-1基因聚集在與木質素合成有關的4CL Ⅰ亞族。實時熒光定量PCR轉錄表達發現，在胡蘿卜根生長發育期間，Dc4CL-1基因在野生胡蘿卜中高表達，而在栽培胡蘿卜中低表達。推測Dc4CL-1基因與胡蘿卜木質素合成有關。

關鍵詞：胡蘿卜;4CL基因;克隆;進化;表達

中圖分類號： S631.201 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）15-0089-06

胡蘿卜（Daucus carota L.）是一種在全世界廣泛栽培的、重要的根類蔬菜[1-2]。然而，高木質素含量會降低胡蘿卜肉質根的口感和質量[3]。有研究表明，4-香豆酰-CoA連接酶（4-coumarate-CoA ligase，簡稱4CL）是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶，是調控木質素和黃酮類代謝途徑中的關鍵限速酶[4-6]。在植物體上，苯丙烷類代謝途徑是一個非常重要的第2代謝途徑;而hydroxycinnamate-CoA硫酯是木質素及其他重要苯丙烷類的前體物質[7-8]。

目前，胡蘿卜基因組在NCBI（美國國家生物信息中心）上已公布、注釋發表了13個4CL基因[9]。但是，在芹菜（Apium graveolens L.）轉錄組中發現有1個4CL基因已發表的胡蘿卜4CL基因非常不同。因芹菜與胡蘿卜同屬傘形科家族，據進化樹分析表明，胡蘿卜與芹菜在分子水平上應具有高度相似性。因此，推測胡蘿卜基因組中有可能存在新4CL基因。

本研究利用發現的芹菜4CL基因序列來設計引物，從野生胡蘿卜貴野中克隆得到1個新4CL基因，命名為Dc4CL-1基因;并構建進化樹，進行序列比對分析，預測其染色體定位等。實時熒光定量檢測Dc4CL-1基因在整個胡蘿卜根生長、發育過程中的表達水平。本試驗進一步研究Dc4CL-1基因在胡蘿卜根木質素合成中的作用，以期延伸其相關知識面及奠定相應的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生胡蘿卜貴野收集于貴州省貴陽市，栽培于貴州省農業科學研究院園藝研究所種質資源圃，無明顯的肉質根，且木質素含量很高;Kuroda是一種在亞洲廣泛栽培的胡蘿卜品種，有明顯的肉質根，且木質素含量很低。將野生胡蘿卜貴野和栽培胡蘿卜Kuroda的種子播種于含蛭石混合物（土壤與蛭石體積比為3 ∶ 1）的塑料花盆中，置于人工氣候箱中培養（晝、夜溫度分別為25、22 ℃，光—暗周期為12 h—12 h，光照度為 3 000 lx）。于種子發芽后第3、5、8、20、40、60、90天時，分別將野生、栽培胡蘿卜的根分離出來，立即用液氮處理，保存在-70 ℃冰箱中。

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用RNA simple Total RNA kit試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取樣品中的總RNA，再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的數量與質量，采用ND-1000分光光度計（Nanodrop Technologies，Inc.）進行總RNA的濃度測定，利用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將提取的總RNA反轉錄成一鏈cDNA。將cDNA稀釋15倍，放在-20 ℃冰箱中保存，用于胡蘿卜Dc4CL-1基因的克隆及實時熒光定量分析。

1.3 胡蘿卜Dc4CL-1基因的克隆

根據芹菜Ventura轉錄組數據中的4CL基因序列，用Primer Primier 5軟件設計胡蘿卜Dc4CL-1基因的正反引物序列（Dc4CL-1F和Dc4CL-1R）[10]。引物序列如下：Dc4CL-1F：5′-ATGGAGAAATCAGGGTACGGGAGAG-3′;Dc4CL-1R：5′-TCAGATTTTGGCTCTGACTTGCTC-3′。擴增PCR體系均為25 μL，反應條件為：98 ℃預變性5 min;98 ℃ 變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，34個循環;最后72 ℃延伸2 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，用PCR提純試劑盒提純、再回收目的片段（諾唯贊生物科技股份有限公司）?；厥蘸蟮哪康钠芜B接到pMD19-T載體上，并轉化到大腸桿菌（Escherich coli）DH5α上，隨后進行質粒的酶切與鑒定，委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行DNA測序。

1.4 序列比對和進化分析

將NCBI上獲得的其他胡蘿卜4CL蛋白序列與本研究克隆得到的序列用DNAMAN軟件對所有序列進行多重比較分析。用MEGA 5軟件分別通過鄰接法（NJ）、最大簡約法（MP）、最大似然法（ML）、最小進化法（ME）、非加權配對平均法（UPGMA）算法對胡蘿卜4CL及其他物種的4CL蛋白序列構建進化樹，并進行進化分析[11]。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR采用高特異性染料法定量PCR檢測試劑盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），按照操作說明進行，于熒光定量PCR儀StepOnePlusTM中進行3步法反應程序實時熒光定量PCR擴增，使用 2-ΔΔCT值法來分析該基因的相對表達水平。qPCR反應條件：95 ℃預變性 5 min;95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，95 ℃延伸 10 s，40個循環;熔點曲線為65～95 ℃，每 0.5 ℃ 增加1個梯度。DcActin1作為胡蘿卜內參對照基因，其正向序列為5′-CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3′，反向序列為5′-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3′[12-13]。根據克隆到的Dc4CL-1基因序列用Primer Primier 5軟件的設計定量引物（正向序列，5′-TCTCCCAACTCACTTCACTTCCC-3′;反向序列，5′-TTCAACATTTTCATCAAACCCCA-3′）。在非冗余蛋白序列（Nr）數據庫中，利用BLASTn搜索得到分離的Dc4CL-1基因（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。qPCR-RT數據用IBM Statistics 20.0軟件進行方差顯著性分析（ANOVA），所有數據重復3次。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜Dc4CL-1基因的序列分析

根據芹菜Ventura轉錄組數據中的4CL基因序列，設計1對正反引物序列（Dc4CL-1F和Dc4CL-1R），在野生胡蘿卜貴野中成功擴增、克隆得到1個新4CL基因片段，命名為Dc4CL-1。Dc4CL-1基因長1 635 bp，編碼544個氨基酸;而芹菜4CL基因長1 620 bp，編碼539個氨基酸（圖1、圖2）。野生胡蘿卜Dc4CL-1基因與芹菜4CL基因有89.79%的同質性（圖1）。據胡蘿卜基因組數據庫結果顯示，此基因位于胡蘿卜基因組第2染色體上（GenBank：LNRQ01000002.1，區域：21 933 004～21 937 748，共4 745 bp），包含5個內含子和6個外顯子。然而，本研究得到的胡蘿卜Dc4CL-1基因的DNA全長4 749 bp，同樣包含5個內含子和6個外顯子（圖3）[14]。結果還顯示，此基因序列中包含完整的4CL保守結構域及AMP結合位點及CoA結合位點。此外BLASTp預測胡蘿卜基因結果顯示出，4CL蛋白是一種似4-香豆酰-CoA連接酶，同樣Dc4CL-1蛋白屬于AFD（adenylate forming domain）Ⅰ亞族（圖3）。

2.2 Dc4CL-1蛋白的進化分析

本研究發現，在NCBI上共注釋、公布了13個胡蘿卜4CL基因，但是其中有2個4CL基因（GenBank：XM_01739850.1和XM_017398506.1）具有相同的開放閱讀框（ORF）和氨基酸序列（XP_017253996.1和XP_017253995.1）。因此，舍棄前者（XP_017253996.1），將其他12個胡蘿卜基因蛋白（GenBank：XP_017215228.1、XP_017215416.1、XP_017222125.1、XP_017229849.7、XP_017232211.1、XP_017234894.1、XP_017243044.1、XP_017244257.1、XP_017253062.1、XP_017253894.1、XP_017253995.1、XP_017258809.1）與芹菜及得到的胡蘿卜Dc4CL-1蛋白一起構建進化樹，進行進化關系分析。本研究運用MEGA 5軟件對此14個蛋白用不同方法進行聚類分析，聚類結果如圖4所示。進化樹顯示，Dc4CL-1、Ag4CL蛋白質及其中1個胡蘿卜4CL蛋白質（XP_017253894.1）在5種不同進化分析方法下均位于同一分支上（圖4，以方框標注出）。蛋白序列比對結果顯示，Dc4CL-1蛋白質和其他物種的4CL蛋白質序列具有72.98%的同源性（圖4）。由此推測， Dc4CL-1是胡蘿卜4CL基因家族的新成員，其功能與其他成員具有相似性。

2.3 胡蘿卜Dc4CL-1基因的表達分析

胡蘿卜Dc4CL-1和4CL蛋白質都屬于參與木質素合成的AFDⅠ亞族成員;與前人在水稻[5]、煙草[15]的研究結果相一致。已有研究表明，在胡蘿卜生長、發育期間，野生胡蘿卜根中木質素含量高于栽培品種[16-17]。本研究結果表明，在胡蘿卜生長、發育期間，Dc4CL-1基因在野生品種中表達量較高，而在栽培品種中表達水平較低。尤其在種子發芽后60、90 d，其表達水平差異極顯著（P<0.01）。野生品種在發育期間，Dc4CL-1基因相對表達水平變化沒有明顯的規律，但均較高（圖5）。

3 討論與結論

木質素是一種自然無組織的高分子聚合物，在維管植物中起著支撐其結構剛度和維持顏色的重要作用[18-19]。生產樹木中木質素結構或含量的變化對于造紙工業和生物燃料的生產也具有重要性[6，20]。然而，肉質根作為胡蘿卜可食用的器官，木質素含量過高會降低胡蘿卜根的口感及質量[17，21]。外源赤霉素[17]、處理加工[22]及成熟化[21]都會影響胡蘿卜根中木質素的含量。此外，胡蘿卜木質素含量的降低對其繁殖、栽培也有一定的影響。有研究顯示，香蕉（Masa nana）A基因組中有25個4CL基因同源序列，其中Mu4CL15在煙草中過表達能夠增加煙草植株莖稈的木質素含量和抗倒伏能力，推測Mu4CL15極有可能提高香蕉植株假莖的抗倒伏能力。有研究表明，胡蘿卜木質素大部分沉積在胡蘿卜木質部導管的細胞壁上;在胡蘿卜發育過程中[23]，木質素含量呈現連續下降的趨勢，推測這可能與木質素生物合成相關基因的表達量降低有關[24]。本研究結果顯示，Dc4CL-1基因在野生胡蘿卜中高表達，而在栽培胡蘿卜中低表達，推測Dc4CL-1基因與胡蘿卜木質素的合成有關。

4CL基因是木質素合成的關鍵限速酶的調控基因，且4CL與植物腺苷酸構成酶的大亞組有關，由多拷貝基因編碼;在其他蔬菜作物中已有相關報道，如白楊、水稻和煙草[5，15]。4CL氨基酸序列的系統重建顯示，4CL蛋白分別劃入Ⅰ、Ⅱ 2個亞組;其中，Ⅰ亞組4CLs與木質素及其他苯丙脂類的合成有更近的關系，而Ⅱ亞組4CLs與黃酮類有更近的關系[4-5，25]。有關于海南龍血樹（Dracaena cambodiana）的研究表明，Dc4CL1屬于ClassⅢ類4CL，血竭誘導劑能夠誘導Dc4CL1基因的表達，為進一步闡明Dc4CL1基因在海南龍血樹中類黃酮生物合成中的功能提供幫助[26]。在水稻的研究中發現，4CL基因家族有5位成員，其中Os4CL2屬于TypeⅡ亞組，其他4位成員屬于TypeⅠ亞組;研究還得出，Os4CL3表達量的降低顯著影響木質素的合成且效果最好，降低植物體木質素含量，降低植株株高[27]。這些試驗結果均表明，可以通過調節4CL基因的表達量來調控植物木質素的含量。

本研究通過BLAST比對和系統分析發現，野生胡蘿卜中的新4CL屬于Ⅰ亞組。無論野生胡蘿卜，還是栽培胡蘿卜，Dc4CL-1基因的表達水平與胡蘿卜的總木質素含量呈正相關關系，由此推測 Dc4CL-1基因可能參與胡蘿卜木質素的合成。但有報道說，根據胡蘿卜基因組注釋，4CLs均屬于Ⅰ亞組。胡蘿卜木質素的合成是一個復雜的過程，其不僅受多基因的影響，同時也受栽培環境、管理方式的影響，須要全方位深入研究。因此，須要發掘胡蘿卜其他新4CL基因，乃至與木質素合成的相關基因都研究彼此之間的相關性及各基因的具體功能，并進行相關深入的研究，為植物木質素的相關研究提供更加有力的理論基礎。

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