“四大家魚”魚骨鈣的組成分析

郭洪壯，胡月明，王輝，涂宗財,2,3*

1(南昌大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)2(江西師范大學，國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌，330022)3(江西師范大學，江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌，330022)

CompositionofcalciuminthebonesoffourmajorChinesecarps

GUO Hongzhuang1,HU Yueming1,WANG Hui1,TU Zongcai1,2,3*

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)2 (National R&D Center for Freshwater Fish Processing (Nanchang), Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)3(Engineering Research Center for Freshwater Fish High-value Utilization of Jiangxi Province, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

Keywordsfour major Chinese carps; Raman spectroscopy; X-ray photoelectron spectroscopy; X-ray diffraction; the composition of fish bone calcium

我國是世界淡水漁業大國，青魚、草魚、鰱魚、鳙魚作為傳統“四大家魚”，養殖歷史十分悠久，其產量一直位居前列，直到今天，仍然是我國淡水魚類養殖的主體魚類[1]。2017年全國淡水魚類養殖產量2 540.98萬t，其中草魚、鰱魚、鳙魚位居前三[2]，青魚雖產量較低，但因其口感優良，也深受消費者喜愛。

魚骨是魚體中軸骨(頭骨和脊骨)、附肢骨(奇鰭骨和偶鰭骨)和魚刺的總稱[3]，占魚體總質量的10%～15%[4]，在魚體中主要起支撐與保護功能。作為魚類加工過程中產生的下腳料之一，魚骨常被當成加工廢料處理，隨意傾倒和掩埋，嚴重污染環境，或者用作生產飼料和肥料，經濟效益很低。因此為了提高魚骨的利用價值，在食品工業中，魚骨常被加工成各種補鈣產品，如活性鈣[5]、螯合鈣[6]等，但是魚骨鈣的組成形式尚未探究清楚，研究者們一般將其簡單定義為羥基磷灰石，更為詳細的組成形式鮮見報道。前人報道，人骨中的鈣鹽主要以結晶的磷灰石(60%)和無定形的CaHPO4(40%)形式存在[7]，而魚骨的鈣鹽還未有這樣的探索?！八拇蠹音~”魚骨是重要的高值化加工原料，不同魚骨鈣的組成形式對其加工利用存在一定的影響，例如酸法是最常用的利用魚骨鈣的方法，而在1個標準大氣壓、25 ℃下，CaHPO4的溶解度約是Ca3(PO4)2的68倍[8]，其與酸反應的速率與產物也不一致。

因此，本文以“四大家魚”魚骨為原料，通過紅外光譜、掃描電鏡、拉曼光譜、X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)、X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)等手段，結合光譜學、食品學、材料學等方向內容對其魚骨鈣的組成形式進行研究，以期能夠詳細分析出“四大家魚”魚骨鈣的組成形式，為魚骨鈣的綜合利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青魚、草魚、鰱魚、鳙魚各3條，江西省南昌市江大南路菜市場，體重規格均為2～3 kg，取其脊骨；氯仿、H2O2、無水乙醇(分析純)，西隴科學股份有限公司；甲醇(分析純)，國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀，美國熱電尼高力公司；JSM 6701F型場發射掃描電鏡帶能譜儀，日本電子公司；ESCALAB250Xi型X射線光電子能譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；LabRAM HR型激光拉曼光譜儀，法國Jobin Yvon公司；D8 Advance型X射線衍射儀，德國Bruker公司；SXL-1002型程控箱式電爐,上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅外光譜

魚骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1溶液中完全浸沒6 h，再經超純水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。采用壓片法對魚骨粉進行紅外光譜分析，取適量魚骨粉與KBr共同壓片，放入紅外光譜儀測量，測量參數為儀器分辨率4 cm-1、掃描累加32次、掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.2 掃描電鏡

魚骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸沒6 h，再用體積分數為30%的H2O2浸泡48 h，使用雙蒸水于超聲機內清洗2 h，無水乙醇脫水，真空冷凍干燥，取若干顆粒噴金后放入掃描電鏡觀察。

1.3.3 XPS

魚骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸沒6 h，再經超純水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。將適量魚骨粉放入樣品臺正中間，用X射線光電子能譜儀測量，測量參數為源槍類型Al靶(1 486.6 eV)、光斑650 μm、 掃描步長0.100 eV，結果用XPSPEAK41軟件分析。

1.3.4 拉曼光譜

魚骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸沒6 h，再經超純水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。將適量魚骨粉放在樣品室內，用拉曼光譜儀測量，測量參數為激發波長632.8 nm、光譜儀焦長800 mm、掃描頻移范圍300～3 500 cm-1，結果用PeakFit v4.12軟件(Systat 公司，美國)分析。

1.3.5 XRD

魚骨經900 ℃灰化8 h后研磨成粉。將適量魚骨粉放入樣品臺正中間，用X射線衍射儀測量，測量參數為光源Cu-Kα(λ=1.540 56 nm)、檢測電壓40 kV、電流80 mA、掃描角度5°～80°、掃描步長2 °/s，結果用X′Pert HighScore Plus軟件(帕納科公司，荷蘭)分析。

1.3.6 數據處理

同種魚的3條魚骨作為3個平行，所有實驗均重復3次；文中需要繪制的圖均使用Originpro 8.0軟件進行繪制；數據利用SPSS 17.0軟件(SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA)中的Duncan’s test進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 紅外光譜分析

圖1 四種魚骨的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of four kinds of fish bones

2.2 掃描電鏡分析

魚骨經過脫脂、脫蛋白處理后，通過掃描電鏡可以看到骨中鈣鹽的形貌，結果如圖2所示。首先可以看到鰱魚骨上出現了許多孔洞，這可能是因為鰱魚骨中膠原蛋白含量比較高[10]，與鈣鹽結合的較多，膠原蛋白被過氧化氫脫去形成孔洞。另外4種魚骨的鈣鹽都存在多種形貌，前人報道骨中不同類型鈣鹽的形貌是不同的，以羥基磷灰石為代表的晶體鈣鹽多以片狀形式存在[11]，非晶體鈣鹽多以無定形的CaHPO4形式存在，這說明4種魚骨的鈣都可能以羥基磷灰石與無定形的CaHPO4的形式存在。

1-青魚；2-草魚；3-鰱魚；4-鳙魚；a-放大100倍；b-放大500倍；c-放大1 000倍圖2 四種魚骨的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope of four kinds of fish bones

2.3 XPS分析

XPS可以根據譜圖中各種元素的特征峰位，確定魚骨中各種元素的化學價態。圖3為4種魚骨的XPS全譜掃描圖。通過4種魚骨Ca、O、P的特征峰位，Ca 2p特征峰處于350.6與347.0 eV，O 1s特征峰處于531.0 eV，P 2p特征峰處于133.0 eV附近，可以確定4種魚骨中Ca，O，P的價態分別為+2，-2和+5價[12]，磷酸鹽以正磷酸鹽的形式存在。

圖3 四種魚骨的XPS全譜掃描圖Fig.3 XPS full-spectrum scanning images of four kinds of fish bones

通過對4種魚骨XPS譜圖上Ca、P的特征峰進行擬合分析，利用其峰面積進行計算，可以得出4種魚骨的Ca、P兩種元素原子數的比值(Ca/P)，結果如表1所示。已知純羥基磷灰石中Ca/P約為1.67，4種魚骨的Ca/P都比1.67小，依次為青魚骨1.40、草魚骨1.38、鰱魚骨1.25、鳙魚骨1.27，這說明4種魚骨中都存在一定量的無定形CaHPO4，致使P元素原子數增多，Ca/P減小。

表1 四種魚骨鈣的Ca/P的比較Table 1 Comparison of Ca/P of four kinds of fish bones

經過對Ca進行窄譜掃描、荷電校正后得出4種魚骨Ca的精確峰位。4種魚骨Ca的峰位與峰間距存在一定的差異，其中草魚骨與其他3種魚骨的差異最為顯著，其峰位出現在347.05和350.70 eV處，均大于其他3種魚骨(圖4)。通常當被測原子與電負性大的原子結合時，其原子核外電子云密度會減小，會導致其XPS峰向高結合能方向位移[13]。草魚骨峰位出現了整體向高結合能方向移動的情況，可能是由于相比其他3種魚骨，草魚骨Ca存在的形式是不同的，羥基磷灰石OH-發生更多的F-取代，晶格畸變更明顯。

圖4 四種魚骨Ca的XPS窄譜掃描圖Fig.4 XPS Narrow Spectra of Ca of four kinds of fish bones

2.4 拉曼光譜分析

a-原始數據；b-處理圖圖5 四種魚骨的拉曼光譜及部分處理圖Fig.5 Raman spectra and partial treatment diagrams of four kinds of fish bones

表2 四種魚骨的比值與礦物結晶度的比較Table 2 Comparison of and mineral crystallinity of four kinds of fish bones

磷灰石是晶體，但骨中鈣也會以非晶體的無定形CaHPO4的形式存在[17]，礦物結晶度一定程度上可以代表磷灰石的含量，結果為青魚>草魚>鳙魚>鰱魚。

青魚骨與草魚骨的無定形CaHPO4質量分數接近40%，與成人骨較為接近，而鰱魚骨與鳙魚骨的無定形CaHPO4質量分數超過了60%，比人骨要高；磷灰石的含量是羥基磷灰石與碳酸磷灰石含量的加和，結果為青魚>草魚>鳙魚>鰱魚，該結果與拉曼光譜的結晶度數據一致；人骨中碳酸磷灰石質量分數在4%～8%[19]，而4種魚骨的碳酸磷灰石含量都超出許多，這可能與其生活習性有關。碳酸磷灰石與無定形CaHPO4的溶解度比羥基磷灰石要高，易被酸溶解，所以提取酸溶性鈣或熬制骨湯，鰱魚骨和鳙魚骨更為合適。

表3 四種魚骨的羥基磷灰石、碳酸磷灰石、無定形CaHPO4質量分數的比較 單位：%

2.5 XRD分析

灰化后的青魚、草魚、鰱魚、鳙魚骨尋出了相同的物相，只是含量有所不同。草魚骨中尋出了含量較多的硒磷灰石，含量較少的氯磷灰石，且羥基磷灰石含量最低，氟磷灰石含量最高，這與XPS的分析結果是基本一致的。草魚肉中含有硒元素，部分沉積到骨鈣中，提高了骨的硒含量，但氟元素含量比較高，一定量的氟會帶來許多病痛，大量的氟甚至會導致人中毒[21]，因此相比其他3種魚骨，對草魚骨的利用要慎重。

圖6 四種魚骨的XRD圖Fig.6 XRD patterns of four kinds of fish bones

表4 四種魚骨的磷灰石物相及各自質量分數的比較單位：%

羥基磷灰石由于具有獨特的生物相容性、骨傳導性和誘導性，被廣泛應用于各種生物醫學材料中，魚骨為原料生產的羥基磷灰石純度較好、成本低廉，且研究者們對其進行細胞毒性實驗發現無明顯毒性[22]。因此魚骨中的鈣不僅可以加工成補鈣產品，而且可以用作生產羥基磷灰石。

磷灰石在骨中以六方晶系的結構存在，經過搜索晶胞與修正晶胞后，得到4種魚骨的晶胞參數。其中青魚骨晶胞參數a=b=0.941 5 nm、c=0.686 9 nm、V=0.527 368 nm3；草魚骨a=b=0.940 5 nm、c=0.685 7 nm、V=0.525 309 nm3；鰱魚骨a=b=0.941 6 nm、c=0.687 6 nm、V=0.528 009 nm3；鳙魚骨a=b=0.941 5 nm、c=0.687 2 nm、V=0.527 527 nm3，可以看出,4種魚骨的晶胞參數大小是鰱魚>鳙魚>青魚>草魚，這可能與F-的取代有關，F-比OH-的體積要小，當F-取代OH-時會使晶胞參數變小。本文參考的標準卡片01-084-1 998顯示純的羥基磷灰石的晶胞參數為a=b=0.941 7 nm、c=0.687 6 nm、V=0.527 910 nm3，與青魚、鰱魚、鳙魚骨灰化后的晶胞參數較為接近，因此這3種魚骨灰化得到的羥基磷灰石純度較高，可以作為一種優質的羥基磷灰石加工原料。

3 結論

本文創新性的利用多組光譜和掃描電鏡數據，結合光譜學、食品學、材料學等方向內容，構建了一種分析“四大家魚”魚骨鈣組成形式的方法。該方法簡便、快速、準確度高，能較詳細地分析出樣品的骨鈣組成形式，為魚骨鈣的綜合利用提供更多的科學依據，也為研究其他物種的骨鈣組成形式提供一定的參考。

青魚骨與草魚骨的無定形CaHPO4質量分數接近40%，與成人骨較為接近，而鰱魚骨與鳙魚骨的無定形CaHPO4質量分數均超過了60%，比人骨要高；4種魚骨的碳酸磷灰石含量都比人骨超出許多。根據碳酸磷灰石與無定形CaHPO4的含量，得出鰱魚骨和鳙魚骨更為適合提取酸溶性鈣或家用熬制骨湯。草魚骨不僅含有硒，也有許多氟，因此相比其他3種魚骨，草魚骨的利用要慎重。青魚、鰱魚、鳙魚骨灰化后的晶胞參數與純羥基磷灰石更為接近，因此這3種魚骨可以作為一種優質的羥基磷灰石加工原料。這些結果可以為“四大家魚”魚骨鈣的綜合利用提供一定的理論依據。