地衣芽孢桿菌的分離和鑒定

布帕提買木·麥麥提 潘姣姣 阿迪萊·卡哈曼 伍麥爾·麥海提陳薈旭 張秋林 李蓮瑞

摘 要：為了從土壤中分離得到地衣芽孢桿菌，開展后續研究，試驗采集塔里木盆地的土壤進行細菌培養，采用臺盼藍平板方法，對分離培養得到的單菌落進行生物學特性研究、生理生化試驗和16S rDNA鑒定。根據《伯杰細菌鑒定手冊》，初步鑒定為芽孢桿菌，提取DNA進行PCR擴增并送測序。結果表明，從塔里木盆地土壤中分離得到的細菌為地衣芽孢桿菌，說明該土壤中存在地衣芽孢桿菌，并為后續進一步研究及應用奠定基礎。

關鍵詞：土壤;分離和鑒定;16S rDNA;地衣芽孢桿菌

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200915005

收稿日期：2020-08-17

基金項目：大學生創新項目（項目編號：201810757029）

作者簡介：布帕提買木·麥麥提（1996-），女，碩士在讀。研究方向：動物性食品衛生與安全;通信作者李蓮瑞（1968-），女，博士，教授。研究方向：動物性食品衛生與安全。

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）為革蘭氏陽性菌，廣泛分布于微生物混合培養物中[1]。呈桿狀，芽孢為橢圓形，孢囊稍膨大，為非致病性菌，細菌最適生長溫度約為50℃，酶的最適生長溫度為37℃。地衣芽胞桿菌耐熱、含酶量多、產酶量高的優良特性被廣泛應用于工業生產中，主要用來生產淀粉酶[2]及蛋白酶[3]。芽孢桿菌具有耐酸、耐鹽、耐高溫等特點，這使得其可以在條件不利的情況下形成芽孢，自我保護，并在環境適宜的條件下復活。地衣芽孢桿菌在代謝過程中能產生多種酶和活性物質，具有益生保健[4]，降解農藥[5]和凈化水體[6]的作用。為了解塔里木盆地土壤中是否存在地衣芽孢桿菌，本試驗從塔里木盆地的1份土壤中篩選出1株鏡檢有芽孢的單菌落，對該菌株進行分離純化，經過生理生化實驗鑒定、16S rDNA基因測序，最終鑒定為地衣芽孢桿菌，且為后續開展地衣芽孢桿菌的應用研究奠定基礎。

1?材料

1.1?樣品采集

新疆塔里木大學校園肥沃菜地距地表20～80cm土樣。

1.2?主要試驗儀器

恒溫培養箱（型號為GHP-9080），購自上海一恒科學儀器有限公司;小型臺式高速離心機（型號為Eppendorf 5453），購自北京創世云博科技發展有限公司;潔凈工作臺（型號為SW-CJ-2ED），購自上海五久自動化設備有限公司;顯微鏡（型號為尼康 ECLIPSE Ci-L），購自成貫儀器（上海）有限公司;搖床（型號為ZWY-2102C），購自濟南宇晗醫療器械有限公司;加熱制冷循環器（型號為JULABO Labortechnik GmbH F12），購自優萊博技術（北京）有限公司。

1.3?試驗藥品

鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、明膠、氯化鈉、七水硫酸鎂、淀粉、硫酸銨、盧哥氏碘液、硝酸鉀、格里斯亞硝酸鹽試劑、0.04%酚紅、Ehrlish試劑、二甲苯、DL-苯丙氨酸、10%氯化鐵、磷酸二氫銨、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、0.1%酪氨酸、臺盼藍、瓊脂粉、酵母粉、酵母膏、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、濃鹽酸、可溶性淀粉，均為國產;牛肉浸粉、牛肉膏、蛋白胨，均購自Sigma公司。

2?方法

2.1?細菌的分離處理

2.1.1?制樣品稀釋液

取樣品土壤500g置于80℃烘箱中烘烤24h，過篩，稱取150g土壤放入燒杯中，加水至350mL，煮沸15min，過濾，取濾液，制成1∶10濃度的懸液。另取裝有無菌水的試管6支，編號10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6進行梯度稀釋，移取500μL 10-1管中土壤懸液于10-2管中混勻，然后移取500 μL 10-2管中土壤懸液于10-3管中混勻，直至稀釋到10-6管，另取500μL 10-6管中液體棄去。

2.1.2?培養

從10-4、10-5、10-6管的稀釋液中取150μL滴加到臺盼藍選擇培養基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養基倒置培養于37℃恒溫箱中，培養24h。

2.1.3?分離單菌落

挑取有透明圈的單菌落，接種于滅菌的LB液體培養基中，置于37℃，180rpm搖床中培養6h。

2.1.4?純化

采用平板涂布法，用微量移液器分別移取20μL、50μL、100μL、150μL、200μL均勻涂布于LB固體培養基上，37℃恒溫培養24h，并重復此步驟多次達到純化。

2.2?生物學特性研究

2.2.1?菌落培養特征

在臺盼藍選擇培養基上進行培養，觀察并記錄。

2.2.2?菌體形態觀察

挑取培養的單菌落，進行革蘭染色與孔雀石綠染色，鏡檢，觀察形態。

2.2.3?革蘭染色[7]

用接種環挑取LB平板上生長的單菌落，在滴有蒸餾水的載玻片上均勻涂開，將涂好的玻片用酒精燈火焰固定，在涂片處用結晶紫染色液處理1min，用水沖洗干凈;碘液處理1min，用水沖洗干凈;95%的乙醇脫色處理30s，用水沖洗干凈;沙黃復染15s，用水沖凈，烘干，油鏡下觀察。

2.2.4?孔雀石綠染色[8]

切片用飽和的孔雀石綠水溶液染10min，蒸餾水沖洗;0.5%番紅復染30s;水洗，吸干;鏡檢，芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

2.2.5?血平板試驗

采用新疆多浪綿羊血制作血平板，將菌株接種于血平板上，觀察溶血現象。

2.3?細菌的生化鑒定

地衣芽孢桿菌鑒定參考《常見細菌系統鑒定手冊》[9]及《伯杰細菌鑒定手冊》[10]的方法，對分離的細菌進行鑒定。

2.3.1?檸檬酸鹽利用試驗

無菌條件下，將單菌落接種于檸檬酸鹽培養基中，37℃恒溫培養3～7d，觀察顏色變化。

2.3.2?丙酸鹽利用試驗

將菌種劃線接種于丙酸鹽培養基上，37℃恒溫培養，連續3代移種，觀察顏色變化。

2.3.3?淀粉水解試驗

用接種環取菌種涂布在培養基表面，37℃恒溫培養24～48h，取出后滴加碘液，觀察菌落周圍變化。

2.3.4?卵黃卵磷脂酶試驗

接種環取少量幼齡菌種（培養18～24h）涂布于卵黃卵磷脂酶平板上，37℃恒溫培養24～48h，觀察菌落四周是否出現不透明區。

2.3.5?硝酸鹽還原試驗

取純培養物接種于硝酸鹽培養基中，37℃培養18～24h，加入試劑3～5滴，30s內出現紅色為陽性。

2.3.6?吲哚試驗

將菌種接種于蛋白胨水培養基中，37℃恒溫培養24h后，取出加入2mL二甲苯，搖勻靜置，沿試管壁緩慢加入Ehrlish試劑2mL，靜置，觀察顏色變化。

2.4?地衣芽孢桿菌16S rDNA的鑒定

2.4.1?基因組DNA的提取

細菌DNA提取方法按照北京全式金生物技術有限公司DNA提取試劑盒（M10208）說明書進行操作。

2.4.2?16S rDNA基因擴增

選擇通用引物擴增芽孢桿菌16S rDNA的全長序列。細菌通用引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，進行PCR擴增。PCR擴增體系：DNA模板1μL;上游引物和下游引物各1μL;EasyTaq Super Mix 25μL，加入ddH2O補至50μL。PCR擴增程序：94℃預變性5min;94℃變性30s，55℃退火30s;72℃延伸90s;35個循環;72℃再延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。

2.4.3?純化和測序

PCR產物經純化后與pMD19-T載體連接，送由北京天一輝遠有限公司測序，將測定的序列通過NCBI/BLAST工具進行序列比對，確定其具體的菌屬。

3?結果與分析

3.1?細菌的培養

對菌液用無菌水分別進行6個梯度稀釋，置于臺盼藍篩選平板上。結果表明，隨著稀釋倍數的增大平板上生長的菌落數減少，逐漸出現單菌落。

3.2?細菌形態

挑取白色透明圈的單菌落，進行革蘭染色，鏡檢結果見圖1，待檢菌革蘭染色呈陽性，菌體呈直桿狀，兩端鈍圓?？兹甘G染色鏡檢結果見圖2。

3.3?菌落形態及血平板毒力測試

將該菌接種于LB固體培養基上，觀察菌落呈圓形、扁平、表面粗糙，邊緣不整齊，灰白不透明，培養24h后菌落趨于相互融合，菌苔表面出現山丘狀和裂葉狀（見圖3）;將該菌劃線接種于血平板上，培養24h后，未出現溶血環，觀察落菌形態邊緣光滑，不規則，表面濕潤，無透明或不透明的灰白色小菌落（見圖4）。

3.4?生理生化實驗鑒定結果

3.4.1?丙酸鹽利用、檸檬酸鹽利用實驗結果

在丙酸鹽利用試驗中，將菌種劃線接種于丙酸鹽培養基上，培養基變藍，實驗結果為陽性;在檸檬酸鹽的利用試驗中，適溫培養4d后，培養基對光旋轉呈藍色，實驗結果為陽性。

3.4.2?淀粉、卵黃卵磷脂、硝酸鹽還原試驗結果

將該菌接種于淀粉培養基培養24h后，滴加碘液，菌落周圍出現不變色透明圈，淀粉水解呈陽性;將該菌接種到卵黃卵磷脂培養基培養24h后，觀察菌落四周有渾濁環出現，表示卵磷脂分解成脂肪，說明分離純化的菌株中含有卵磷脂酶;將該菌接種到硝酸鹽還原為亞硝酸鹽培養基24h后，滴加試劑，30s內出現紅色，表明該菌能將硝酸鹽還原;將該菌接種到吲哚培養基中恒溫培養24h后，取出加入二甲苯和Ehrlish試劑，培養基不變色，實驗結果為陰性。

3.4.3?生化試驗鑒定結果

淀粉水解試驗、丙酸鹽利用試驗、卵黃卵磷脂酶試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用試驗等生物化學試驗鑒定結果見表1。

3.5?16S rDNA的鑒定結果

3.5.1 16S rDNA的擴增結果

由圖5可以看出，成功擴增了該菌的16S rDNA的基因序列。

3.5.2?16S rDNA克隆鑒定結果

該細菌16S rDNA的基因序列與pMD19-T連接后轉化DH5α，提取質粒送測序，陽性克隆鑒定如圖6。

3.5.3?16S rDNA的序列進化樹同源性分析結果

將測序所得序列去掉相關的載體序列后，得到該菌的全長16S rDNA序列信息。該菌株的16S rDNA長度為1500bp，將其結果提交到NCBI數據庫進行核酸比對后，建立進化樹。分析表明，該菌株與登錄號為KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌處于同一分支，且根據同源性分析，該菌株與登錄號為KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢桿菌同源性為100%，進化樹分析結果見圖7，同源性比較見表2。根據上述結果，可以確定該菌株為地衣芽孢桿菌。

4?結論與討論

面對土壤中龐大的微生物群體，通過對一份土壤進行高溫烘烤處理，培養獲得單菌落，取該菌落在臺盼藍平板上培養，反復純化，最終挑選長出白色透明圈的菌落作為實驗出發用菌，進行革蘭染色和孔雀石綠染色鏡檢后，觀察細菌形態呈桿狀，兩端鈍圓，芽孢中生，孢囊稍膨大，確定分離得到1株芽孢桿菌。通過參考《常見細菌系統鑒定手冊》及《伯杰細菌鑒定手冊》，又結合地衣芽孢桿菌所特有的能夠利用丙酸鹽的特性，初步鑒定為地衣芽孢桿菌。

同時，對該菌進行檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗等一系列的生化鑒定試驗。試驗結果表明，該菌具備地衣芽孢桿菌的不可形成吲哚、不可水解酪氨酸、不具有苯丙氨酸脫氫酶的生化特征，由此可以初步斷定該菌為地衣芽孢桿菌。最終通過對該菌進行DNA提取、PCR擴增、純化及測序，將其16S rDNA基因序列信息進行建立進化樹及同源性分析，進一步確定該菌為地衣芽孢桿菌。

地衣芽孢桿菌在較高溫度下仍能生長繁殖，并且能夠產生淀粉酶和蛋白酶，對有些有害菌如葡萄球菌、白色念珠菌具有明顯的抑制作用。然而，近年來對地衣芽孢桿菌的研究進展仍報道得比較少，雖已證實其擁有良好的使用效果，但具體作用機理機制尚不明確，且其研究主要集中在抗菌特性方面，未來可利用基因工程將該菌的優良特性與其它菌結合，構建和表達出一種更優良的基因，并將其應用到更加廣泛的領域中。試驗結果進一步豐富了我國地衣芽孢桿菌的研究進展，為地衣芽孢桿菌的進一步研究及應用奠定基礎。

參考文獻

[1] 覃建忠，鄧正春，周詩彪，等.大豆施用含地衣芽孢桿菌生物活化酶磷肥試驗[J].作物研究，2017，31（07）：722-723.

[2]莫靜燕，陳獻忠，王正祥.地衣芽孢桿菌原生質體的制備、再生及轉化研究[J].生物技術，2009（05）：75-77.

[3]王利杰，余曉斌，方銀兵，等.可抑制致病菌的益生菌篩選及抑菌物質的初步確定[J].生物技術通報，2017，33（11）：123-129.

[4]?Kim Y，Cho J Y，Ku K J H，et al. Identification and antimicrobial activity of phenylacetic acid produced by Bacillus Licheniformis isolated from fermented Soybean， Chnngkook-Jang[J]. Current Microbiology， 2004， 48 （4）： 312-317.

[5]?Mandal M D，Mandal S，Pal N K.Plasmid-mediated dimethoate degradation by Bacillus Licheniformis isolated from a fresh water fish Labeo rohita[J]. BioMed Research International， 2005， 25 （3）： 280-286.

[6]李木明.降解有機質芽孢桿菌的篩選及其凈化模擬污染水體的特性[D].泉州：華僑大學，2016.

[7]?黃荔豐.微課“革蘭染色”的教學設計[J].課程教育研究，2017（41）：19.

[8]?樊佳，韓煦，陶榆瑋，等.芽孢染色實驗中枯草桿菌最佳培養條件探索[J].實驗技術與管理，2018，35（03）：58-61.

[9]?東秀珠，蔡妙英.常見細菌鑒定手冊[M].北京：北京科學教育出版社，2001.

[10]?伯杰細菌鑒定手冊[M].第九版.科學出版社，1994.

（責任編輯?周康）