藍莓采后病原真菌的分離鑒定及抑制研究

葛達娥 圖爾蓀阿依·圖爾貢 魏照輝 潘玥 王帆 周劍忠 劉小莉

摘要：以兔眼藍莓（品種名為燦爛）為材料，采用組織分離法從自然腐敗藍莓中分離、純化病原真菌，通過形態學觀察及分子生物學技術進行鑒定，并考察肉桂醛、檸檬醛、牛至精油、香芹酚和丁香酚等對4種病原菌的抑制效果。結果表明，分離得到6株病原真菌，分別為1株稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）、1株青霉屬（Penicillium sp.）、3株枝孢屬（Cladosporium sp.）和1株鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌，經致病性試驗確定鏈格孢霉為主要病原菌。牛至精油對4種病原真菌均具有較好的抑制效果，對鏈格孢霉的半最大效應濃度（EC50）為37 mg/L。

關鍵詞：藍莓;病原菌;分離鑒定;牛至精油;鏈格孢霉

中圖分類號： S436.639文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0187-05

收稿日期：2019-11-06

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（18）2018];江蘇省博士后科研資助計劃（編號：2018K094C）。

作者簡介：葛達娥（1994—），女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：1577118942@qq.com。

通信作者：劉小莉，博士，研究員，主要從事食品生物技術研究。E-mail：liuxljaas@hotmail.com。

藍莓是杜鵑花科越橘屬植物。果實含多種功能活性成分，具有抗癌、抗肥胖、預防退行性疾病、抗炎、保護視力和肝臟、預防心臟病、抗糖尿病、改善腦功能等功效[1]。藍莓被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一，具有“漿果之王”的稱號[2-3]。藍莓一般成熟于6—8月，屬高溫多雨季節且果皮柔嫩易受機械損傷，為微生物的入侵和生長繁殖提供了有利的條件，僅存放2～4 d就會發生腐爛變質。郭曉月等從云南澄江地區的藍莓中分離鑒定出3株真菌，分別為枝孢菌屬（Cladosporium sp.）、鏈格孢屬（Alternaria sp.）和匍柄霉屬（Stemphylium sp.）真菌[4]。秦士維等從遼寧省的8個藍莓品種中分離鑒定出相同的病原真菌[5]。隨著藍莓種植面積的擴大，成熟期果實積壓、易腐爛、保存難等問題凸顯，嚴重阻礙了藍莓產業的發展。

研究發現，肉桂醛[6]、檸檬醛[7]、香芹酚[8]、丁香酚[9]、牛至精油[10]等對病原真菌有較好的抑制作用，并能誘導果蔬內防御酶和抗氧化酶活性提高，在很多品種的果蔬防腐保鮮方面具有較好的應用前景，如楊梅[8]、圣女果[11]、荔枝[12]等。本試驗旨在分離和鑒定采后藍莓中的病原真菌，并對其進行抑制試驗，以期為研發藍莓保鮮技術、延長貨架期和預防微生物的危害供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

藍莓（品種名為燦爛，屬兔眼系列），于2019年6月17日采自江蘇省南京市溧水區白馬鎮。肉桂醛、檸檬醛、牛至精油、香芹酚和丁香酚等，均購自江西金源天然香料有限公司，用乙醇溶解并配成1 000 mg/L母液。UNIQ-10柱式真菌基因組抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養基，均購自北京奧博星生物技術有限公司;GIS-3500成像儀，購自上海天能科技有限公司;TH4-200熒光倒置顯微鏡，購自日本Olympus公司;JY300C型電泳儀，購自北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?病原真菌分離

病原真菌的分離鑒定參照白雪等的方法[13]。選擇無機械損傷和病蟲害的成熟果實，采后裝入塑料包裝盒中，當天運回實驗室，將其在室溫下放置至腐敗。采用組織塊分離法從腐爛藍莓果實上分離病原菌，在無菌操作臺中用刀片在藍莓病健交界處取約30 μm×30 μm的組織塊，將切取的組織塊經75%乙醇消毒30 s，用無菌水漂洗3次后置于PDA培養基平板上。將平板置于28 ℃恒溫箱培養3 d后，用接種針在培養出的菌落邊緣挑取少量菌絲移植到另一個PDA培養基平板上培養，重復純化至平板上只有單一菌落。

1.2.2?致病性試驗

采用Lachhab等的方法[14]，制備孢子懸浮液，以病原真菌的孢子懸浮液和菌絲作為接種體對藍莓進行致病性測定。選取無機械損傷、無病害的藍莓果實，先用75%乙醇浸泡30 s，再用無菌水沖洗4次，晾干備用。用消毒接種針在藍莓果實上劃出傷口，在傷口處分別接種孢子懸浮液和菌絲體，以無菌水作為對照。接種24 h后，每隔 1～2 d觀察藍莓傷口處病原真菌的生長情況。

1.2.3?病原真菌的鑒定

1.2.3.1?形態學鑒定

將分離純化的菌株接種在PDA培養基平板上于28 ℃條件下培養，觀察菌絲生長狀況、菌落顏色和質地。通過熒光倒置顯微鏡觀察病原真菌菌絲及孢子的形態并拍照。參照《真菌鑒定手冊》及相關文獻，進行初步的鑒定。

1.2.3.2?分子生物學鑒定

將“1.2.2”節中孢子懸浮液接入PDB液體培養基中培養24 h后收集菌體，凍干，經液氮研磨后用真菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。采用真菌擴增通用引物NS1F：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，NS8R：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，進行18S rDNA基因的聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。PCR反應體系總體積為50 μL，包括模板DNA 1.0 μL，正反向引物各2.0 μL，Premix Tap 25 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min后持續變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 60 s，共38個循環，最后72 ℃延伸5 min。反應結束后PCR產物經過 10 000 mg/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果進行BLAST比對，根據序列同源性從高到低的次序選取模式菌株的序列，利用MEGA軟件以距離矩陣法中的鄰接法（neighbor-joining method，NJ法）構建系統發育樹，并進行Bootstrap分析，重復次數為 1 000 次[15]。

1.2.4?不同精油對病原菌的抑制作用

1.2.4.1?生長速率法

采用生長速率法[16]測定不同精油對B2、B5和B8致病菌絲生長的影響。分別吸取2 mL肉桂醛、檸檬醛、牛至精油、香芹酚和丁香酚等的母液加入到200 mL PDA培養基中，使其終濃度為100 mg/L，混勻后倒入無菌培養皿，備用。用直徑為6 mm的無菌打孔器從培養5 d的致病菌菌落邊緣位置切取菌餅，將菌絲面貼在含精油的平板和對照平板中，對照平板的培養基不含精油。將培養皿置于28 ℃恒溫培養箱內培養5 d后測量菌落直徑，并對其結果進行統計分析。

1.2.4.2?瓊脂擴散法

由于青霉無蔓延性，采用瓊脂擴散法研究不同精油對B4的抑制作用。吸取 2 mL “1.2.2”節中B4的孢子液于200 mL 50 ℃的PDA培養基中，搖勻，倒入無菌平皿中，待培養基凝固后，使用直徑為6 mm的無菌打孔器在抑菌平板上打孔。每孔加入80 μL 10 000 mg/L精油母液，以80 μL 95%乙醇作為對照，于28 ℃培養箱中培養 5 d 后，通過測量透明圈大小觀察抑菌效果。

1.2.5?牛至精油對鏈格孢霉的抑菌效果

分別吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL的牛至精油母液于200 mL PDA培養基中，使牛至精油的終濃度分別為20、40、60、80、100 mg/L。參照“1.2.4.1”節中的方法，研究不同濃度牛至精油對鏈格孢霉的抑制效果。按公式（1）計算牛至精油對鏈格孢霉菌絲生長的抑制率，每組處理重復3次，取其平均值。將抑制率換算成概率值（y），牛至精油濃度（mg/L）換成對數值（x），建立毒力回歸方程（y=ax+b），計算出牛至精油對鏈格孢霉的半最大效應濃度（EC50）。

生長抑制率=（對照菌落直徑-6 mm）-（處理菌落直徑-6 mm）對照菌落直徑-6 mm×100%。（1）

1.3?數據處理

試驗數據采用DPS軟件整理并進行方差分析及差異顯著性檢驗（P<0.05），用Origin Pro 8.5軟件繪制圖形。

2?結果與分析

2.1?病原真菌的分離與形態學觀察

從自然腐爛的藍莓果實上共分離出6株真菌，分別記為B2、B4、B5、B6、B7、B8。

菌株B2在PDA培養基上菌落質地疏松，初期菌絲為白色絨毛狀，呈放射狀擴展，后由中央起漸變成為黑色，最后菌落正反面均為黑色。病菌菌絲分隔明顯，初為無色，后為黑色，分生孢子梗單生，直立，有時分枝，具隔膜。分生孢子頂生于一個無色透明的瓶狀細胞上，扁球狀、近球形，后變黑色（如圖1中a-B2、b-B2、c-B2）。

菌株B4在PDA培養基上菌落呈絨狀，圓形，基本上無氣生菌絲;菌絲開始為白色，逐漸變為青綠色，菌落表面呈顆粒狀，干燥;基質顏色為白色，后變為黃綠色。顯微鏡觀察其菌絲呈掃帚狀;有分生孢子梗和分生孢子，且分生孢子無色，近球形（如圖1中 a-B4、b-B4、c-B4）。

菌株B5、B6、B7在PDA培養基上菌落呈絨狀，綠色，基質顏色由綠色變為黑灰色;鏡檢觀察菌絲具隔膜，孢子為卵形（如圖1中a-B5、b-B5、c-B5）。

菌株B8在PDA培養基上菌絲較長，呈棉絮狀，初期為灰白色，逐漸長滿平皿，最終轉為灰褐色至黑色。鏡檢顯示菌絲體不分枝或分枝較少，具隔膜。孢子具有格紋，暗褐色（如圖1中a-B8、b-B8、c-B8）。

2.2?分子生物學鑒定與系統發育樹構建

將測序結果與GenBank上已登錄的基因序列進行比對，選取相近的參考菌株，利用MEGA 7軟件基于18S rDNA序列采用NJ法構建系統發育樹，結果如圖2所示。從系統發育樹來看，B2菌株與稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）親緣關系較近，初步將B2菌株鑒定為Nigrospora oryzae;B4菌株與青霉屬（Penicillium sp.）聚在一起，親緣關系較近，可將其歸為Penicillium sp.;B5、B6、B7菌株與枝孢屬（Cladosporium sp.）在親緣關系上最近，將B5、B6、B7菌株在分類學地位上歸于Cladosporium sp.;B8菌株與鏈格孢屬（Alternaria sp.）的遺傳距離最近，因此，將其分別歸為Alternaria sp.。結合傳統形態學特征，綜合鑒定結果為B2菌株為稻黑孢霉，B4菌株為青霉，B5、B6、B7菌株為枝孢霉，B8菌株為鏈格孢霉。

2.3?菌株的致病性檢測

B2菌株接種在藍莓果實放置2 d后長出細長的白色菌絲，之后在果皮表面迅速擴展，存放至第7天時，菌絲顏色變深至深褐色。菌株B4導致藍莓出現凹陷癥狀，后長出白色散點狀菌落，繼續培養菌落變為綠色。菌株B5、B6、B7侵染藍莓果實后，在藍莓傷口處長出綠色菌絲，繼續放置，菌絲顏色加深但未擴展出傷口以外區域。菌株B8從藍莓傷口處長出白色菌絲，繼續放置5 d后，菌絲變成灰褐色且鋪滿藍莓表面。經與原始自然腐敗藍莓上菌落的形態與顏色（圖3-A）進行對比，初步斷定B8菌株是導致藍莓腐爛的主要病原菌。

2.4?精油的篩選

根據菌株鑒定結果，B5、B6、B7菌株均為枝孢屬真菌，選擇B5菌株作為枝孢屬真菌的代表進行后續研究。由圖4可知，通過顯著性分析（P<005）發現肉桂醛、檸檬醛、牛至精油、丁香酚和香芹酚等對B2、B4、B5、B8菌株的生長均有一定的抑制作用，且4種病原菌對不同精油的敏感度不同。通過比較菌落直徑發現，相同濃度的精油對B2、B5、B8菌株具有較好抑制作用的是牛至精油和香芹酚，透明圈大小顯示B4菌株對肉桂醛和牛至精油均敏感，因此選擇牛至精油作為抑菌劑并研究其對優勢病原菌的抑制效果。

2.5?牛至精油對鏈格孢霉菌絲生長的抑制作用

由表1可以看出，牛至精油對鏈格孢霉具有一定的抑制效果，隨著牛至精油濃度的提高抑制效果逐漸增強。在較低濃度下，即牛至精油濃度為 20 mg/L 時，就有明顯抑制作用;當濃度為100 mg/L時，菌落延伸量為0。通過計算各處理組的菌絲抑制率，建立毒力回歸方程為y=4.609 3x+15.789 3（r2=0.998 4），根據方程計算出牛至精油對鏈格孢霉的半最大效應濃度（EC50）為37 mg/L。

3?討論與結論

隨著藍莓種植生產面積的擴大，藍莓采后真菌病害引起的藍莓品質下降及貨架期縮短問題顯得越來越嚴重。研究藍莓病害首先就要進行病原菌的分離鑒定，傳統形態學和分子生物技術對病原菌進行鑒定已經成為常用且準確可靠的手段。本研究根據分離出的6個菌株的形態和18S rDNA序列的分析結果，將分離得到的菌株B2、B4、B8分別確定為黑孢屬、青霉屬和鏈格孢屬真菌，B5、B6、B7確定為枝孢屬真菌。經致病性檢測，鏈格孢霉為主要病原菌。據報道，王曉等在枸杞采后貯藏過程中分離鑒定出鏈格孢霉[16]。呂禾等也在晚熟桃采后貯藏過程中分離鑒定出鏈格孢霉[17]。霉菌侵染果實后，不僅對果實外觀及品質產生一定的影響，甚至還能產生毒素，危害到人體的健康，所以有效控制鏈格孢霉侵染采后果蔬至關重要。由于鏈格孢霉菌具有寄生和腐生性的特點，在-2～0 ℃條件下也能夠生存，通常使用的低溫貯藏、氣調保鮮等物理手段不能徹底杜絕采前及采后藍莓表面鏈格孢霉菌對果實的侵害。本試驗以不同精油處理4株病原菌，結果表明，牛至精油對其均具有較好的抑制作用，當濃度為100 mg/L時，能完全抑制鏈格孢霉菌絲的生長，其EC50為37 mg/L。余興等以500 μL/L萱衣草精油、薄荷精油和葡萄籽精油直接作用于鏈格孢霉，其抑制率分別為90.18%、87.09%、20%[18]，說明牛至精油在抑制鏈格孢霉生長方面作用明顯，可以作為一種有效的藍莓采后防腐保鮮劑，具有較大的商業應用前景。

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