外泌體源性miRNA在胃癌中的研究進展

冀春鵬，汪寶林

(南京醫科大學第二附屬醫院普外科，南京 210011)

胃癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。近年來胃癌整體發病率呈上升趨勢，5年生存率較前明顯提升[1]。據統計，2015年我國胃癌發病率位居惡性腫瘤第二位，僅次于肺癌，新發病例約40.3萬[2]。胃癌傳統的治療手段包括手術、化療以及放療，由于我國胃癌早期檢出率較低，多數患者就診時已處于中晚期，傳統手段治療的胃癌5年生存率仍偏低[2-3]。因此，深入研究胃癌的發生發展機制，尋找更加有效的胃癌早期診斷標志物以及潛在的分子作用靶點，對于降低胃癌患者死亡率以及改善生存預后具有重要的臨床意義。

研究發現，胃癌患者血液中外泌體較正常人高近1倍，其中不同腫瘤組織和細胞來源外泌體中所包含的生物活性物質[信使RNA、蛋白質、微RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA、環狀RNA等]可以通過遞送至特異性細胞，進而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[4-5]。miRNA是一種小分子非編碼RNA，廣泛參與胃癌的發生發展，miRNA可以通過直接或間接調控靶蛋白的表達影響腫瘤細胞的生長、增殖、轉移等生物學過程。有研究證實，外泌體源性miRNA具有較好的穩定性，可能成為一種新的腫瘤標志物[6-7]。因此，外泌體源性miRNA有望成為胃癌早期診斷的檢測靶標，為胃癌患者開拓新的治療策略?，F就外泌體源性miRNA在胃癌中的生物學作用進行綜述。

1 外泌體概述

1.1外泌體的生物學特性 外泌體來源于細胞內多囊泡體，經過多囊泡體與細胞膜融合后，釋放至細胞外基質，是一種直徑為40～100 nm的膜性囊泡網。其表面存在特異性的標志物，如CD63、CD9、腫瘤易感基因101蛋白等，通過特異性檢測相關標志物有助于外泌體的提取與分離[7-8]。外泌體的釋放是一種多級別的生物學過程。首先形成多囊泡小體，之后借助熱激蛋白90、Rab家族蛋白等相關驅動分子促使多囊泡小體與細胞膜融合，并將其釋放至細胞外。其中，Rab27b主要通過調節多囊泡小體向細胞質膜轉運，Rab27a主要負責多囊泡小體與細胞質膜融合過程中氣道細胞骨架的重新排列。另外，外泌體的釋放與溶酶體也存在一定的關聯，特異性蛋白質的泛素化修飾可促進多囊泡小體與溶酶體融合，進而減少外泌體的釋放。因此，調控外泌體的合成與釋放對細胞間信息傳遞具有重要意義。研究發現，外泌體中含有多種生物活性物質，包括蛋白質、核酸及脂質等，可由多種不同類型的細胞釋放，在血液、尿液、腦脊液等多種體液中均有分布。外泌體可介導細胞間物質和信息傳遞，參與抗原呈遞、免疫應答、蛋白質和RNA的轉運等生理和病理過程[9-11]。來源于不同細胞的外泌體含有源細胞關鍵的功能分子，其中腫瘤細胞來源的外泌體是目前研究的熱點，外泌體可通過調控細胞間信號轉導，促進血管新生等細胞生物學行為，影響腫瘤細胞代謝狀態、侵襲增殖能力等[12]。因此，研究外泌體源性物質與腫瘤的生長、復發和轉移至關重要。

1.2外泌體源性miRNA 外泌體內含多種RNA，包括信使RNA、長鏈非編RNA和環狀RNA等。其中成熟性miRNA的表達含量最高，約占41.72%[13]。miRNA是一類長為20～24 nt的內源性非編碼小RNA，它可通過與靶基因3′非翻譯區結合，降解靶基因信使RNA或抑制其翻譯，從而降低靶基因的表達水平，參與調控多種基因表達[14]。研究發現，胃癌組織可高表達miR-21、miR-221和miR-421等[15-17]。而外泌體膜脂質分子可以抑制RNA酶活性，從而保證外泌體源性miRNA能夠長時間存在于血液、尿液、腦脊液中?，F已發現外泌體源性有高達2 838種特異性miRNA[18]。不同細胞來源的外泌體會包裹其特異性miRNA等生物活性物質。胃癌細胞源性外泌體、腫瘤微環境源性外泌體以及血漿循環外泌體均可以包裹特定的miRNA，通過與細胞受體結合，細胞質膜融合最終將miRNA遞送至腫瘤組織細胞中，進而參與調控腫瘤細胞的生長、增殖和侵襲等過程[19-20]。

2 外泌體源性miRNA在胃癌發病中的作用機制

2.1調控胃癌的生長、轉移和侵襲 外泌體源性miRNA主要包括腫瘤細胞來源外泌體miRNA、腫瘤微環境來源外泌體miRNA以及循環性血漿來源外泌體miRNA。體外細胞檢測顯示，與正常細胞相比，腫瘤細胞會分泌更多的外泌體[21]。胃癌細胞在生長過程中釋放外泌體作用于自身細胞或其他相關癌細胞，其中外泌體內含miRNA可通過釋放進入胃癌細胞，參與調控腫瘤細胞的增殖以及轉移。在胃癌細胞株(AZ-P7a)中檢測到大量的胃癌細胞源性外泌體，其中外泌體可以通過將宿主細胞的let-7 miRNA外排進而促進胃癌細胞的增殖和轉移[22]；另有研究通過提取胃癌細胞株(SGC-7091)外泌體并將其與腫瘤相關成纖維細胞共孵育發現，SGC-7091源性外泌體可誘導腫瘤相關成纖維細胞表型轉化。通過miRNA基因芯片分析顯示，SGC-709源性外泌體中miRNA可能通過調控轉化生長因子-β參與腫瘤細胞的黏附、侵襲轉移過程[23]。通過提取食管癌細胞中外泌體miRNA發現，miR-25和miR-210表達顯著增加，其與胃癌細胞共孵育可誘導腫瘤細胞的生長和轉移，導致腫瘤細胞的表型轉化[24]。

腫瘤微環境是指腫瘤細胞所在的外部環境，是腫瘤生長和增殖的基石。有研究發現，腫瘤微環境來源外泌體miRNA可參與調控胃癌的生長與復發[25]。骨髓間充質干細胞作為腫瘤微環境的組成成員，可通過分泌外泌體作用于腫瘤細胞，參與多種腫瘤細胞的病理生理過程。韓偉等[26]研究顯示，骨髓間充質干細胞分泌外泌體源性miR-221能夠轉移到胃癌細胞(HGC-27)，促進HGC-27細胞的增殖與轉移。

循環性血漿來源外泌體在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。既往研究證實，外周血中外泌體源性miRNA的異常表達與胃癌密切相關[27]。外泌體是一種膜性囊泡小體可以保護miRNA被降解。因此，外周血循環miRNA可能成為胃癌的新型標志物。在胃癌患者的血清中發現外泌體源性miR-451、miR-1和miR-221的表達異常增高，進一步研究發現外泌體源性miR-451和miR-221的差異表達水平與胃癌惡性程度呈正相關[28]。另有研究發現，胃癌患者血漿外泌體源性miR-423表達水平顯著升高，診斷效能顯著優于依靠腫瘤標志物的檢測；且外泌體源性miR-423表達水平與腫瘤的轉移程度呈正相關[29]。綜上可知，循環性外泌體源性miRNA差異性表達可能成為胃癌早期臨床診斷的標準。

2.2調控胃癌的免疫微環境 腫瘤免疫微環境的失衡是造成腫瘤異常增殖和生長的重要因素。初期，機體的免疫系統會對腫瘤實行免疫監測，清除相應的免疫源性癌細胞。中期，具有弱免疫源性的腫瘤細胞因為逃脫監測存活下來，致使機體與腫瘤細胞達到一種免疫平衡狀態。后期，由于腫瘤細胞的異常過度增殖以及累積，促使免疫平衡被打破，從而導致腫瘤細胞進入免疫逃逸階段，誘發機體產生惡性病變[30]。因此，通過調控腫瘤細胞的免疫微環境，改善腫瘤微環境對腫瘤的治療至關重要。研究發現，外泌體源性miRNA可以調節免疫微環境(輔助性T細胞17等)進而影響腫瘤的發展過程[31-32]。在胃癌細胞株(MKN-451)中，MKN-451可分泌外泌體源性miR-451，活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路促進T細胞分化為輔助性T細胞17，誘發機體的炎癥反應，最終導致腫瘤進展加快?？梢?，外泌體源性miRNA可作為T細胞的誘導劑，參與胃癌的生長與轉移[33]。

2.3調控胃癌的耐藥作用 外泌體能夠誘導化療藥物的抵抗性，鉑類藥物是胃癌患者常用的基礎化療藥物。在長期的藥物化療過程中，胃癌患者會因此出現腫瘤耐藥現象，導致化療失敗[34]。既往研究發現，外泌體在腫瘤細胞耐藥中發揮重要作用，可能通過阻止藥物與抗體的相互作用，最終導致耐藥的形成[35]。間充質干細胞的外泌體能夠通過激活胞外信號調節激酶信號通路誘導胃癌細胞的抗藥性。Sousa等[36]研究發現，耐藥性腫瘤細胞分泌外泌體能夠降低腫瘤細胞對藥物的敏感性，其機制可能為通過外排藥物和遞送miRNA，提示外泌體源性miRNA可能是腫瘤耐藥的重要機制。在膠質母瘤細胞中，外泌體源性miR-221可以靶向抑制發動蛋白3誘導腫瘤細胞替莫唑胺耐藥的形成。與正常對照細胞相比，M2巨噬細胞分泌外泌體源性miR-21顯著增加。其外泌體源性miR-21與胃癌細胞共培養，結果顯示miR-21通過靶向抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，誘導磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B活化，從而導致胃癌細胞對順鉑的耐藥性[37]。此外，M2巨噬細胞外泌體也可以通過促進Bcl-2表達抑制胃癌細胞放化療時的細胞凋亡[38]。以上研究表明，外泌體能夠通過遞送miRNA作用于胃癌細胞，導致胃癌細胞的耐藥性，促進胃癌的發生發展。

3 外泌體源性miRNA在胃癌診斷中的作用

外泌體包含的相關生物活性物質(核酸、蛋白質等)可以反映源細胞的類型以及生存狀態[39]。因此，通過檢測循環中的腫瘤外泌體有助于胃癌早期診斷和液體活檢[40]。通過檢測腫瘤外泌體可能對胃癌的發生發展做出快速、靈敏的診斷。通過檢測惡性腫瘤腹水中循環外泌體miRNA表達譜發現，miR-21表達顯著增加[41]。其中外泌體源性miR-1225-5p、miR-320c、miR-1202、miR-4270、miR-1207-5p在胃癌患者腹腔灌洗液和胃癌細胞中均高表達，提示可能與胃癌轉移和擴散相關。miR-1225-5p和miR-21的高差異性表達，提示其在胃癌復發和轉移中可能成為有效的生物標志物[41-42]。另有研究對胃癌患者和健康受試者的血漿外泌體miRNA進行表達譜差異性分析，結果顯示，與健康受試者相比，胃癌患者血漿外泌體源性miR-452-5p的表達顯著增加，隨后對68對樣本進行驗證，miR-452-5p的表達同樣顯著增加[43]。許鎮等[44]收集了40例胃癌患者和20例健康受試者的血清標本，分離提取得到血漿外泌體并對外泌體源性miR-27a進行測定，結果顯示胃癌患者血清miR-27a的表達顯著降低，且與胃癌的分級呈負相關。因此，臨床早期篩查miR-27a可能成為胃癌診斷的重要手段。以上研究提示，血漿外泌體源性miRNA可能成為胃癌患者新的潛在生物標志物。外泌體源性miRNA對胃癌細胞的調控作用總結，見表1。

表1 外泌體源性miRNA對胃癌細胞的調控作用

4 外泌體源性miRNA在胃癌治療中的作用

外泌體具有體積小、分布均勻等特點，適合作為納米級別藥物載體，在胃癌的治療中發揮重要作用。外泌體對胃癌的發生、發展有重要影響，外泌體源性miRNA可以通過干預胃癌細胞的代謝過程，最終

miRNA:微RNA；Th17：輔助性T細胞17；DNM3:發動蛋白3；PTEN：人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因；PI3K/Akt：磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B達到治療胃癌的目的。既往研究發現，轉染miR-21抑制劑可以抑制巨噬細胞外泌體對胃癌細胞(BGC-823)的作用，促進癌細胞的凋亡，抑制細胞遷移[45]。以上研究表明，外泌體可能成為一種藥物的載體通過遞送相應的生物活性物質進入胃癌細胞，進而影響胃癌細胞的生長、復發。同樣，使用高劑量質子泵抑制劑能夠通過抑制胃癌細胞外泌體分泌，減少外泌體內含miRNA的表達，抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，增強抗腫瘤藥物的活性[46-47]。在斑馬魚動物模型中，外泌體亦能搭載抗腫瘤藥物并通過血液循環到達腫瘤特定部位，從而抑制腫瘤細胞的生長和增殖[48]。因此，胃癌細胞源性外泌體可能成為一種新型的“轉運載體”并通過搭載抗癌藥物或miRNA治療胃癌[49]。在今后的胃癌診治中，可以通過靶向調控外泌體源性miRNA，進而為胃癌的防治提供新手段。

5 小 結

外泌體中富含眾多的生物活性物質，在胃癌的發生發展中發揮重要作用。其中外泌體源性miRNA參與調控胃癌的生長、轉移、侵襲、免疫微環境、耐藥性形成以及治療等，但其具體的分子生物學作用機制尚不清楚。目前有關外泌體源性miRNA的研究主要集中于細胞水平，有關血漿外泌體源性miRNA與胃癌患者關系和機制的研究較少。因此，未來深入探究血漿外泌體miRNA與胃癌的關系，可能能為胃癌的臨床診斷和治療提供新方法。