固相萃取-UPLC-MSMS法測定水產品中15種磺胺類藥物殘留

彭蕓

摘 要：建立了一種Captiva EMR-Lipid固相萃取柱凈化，用UPLC-MS/MS法測定中15種磺胺類藥殘留的方法。該方法的前處理僅需進行甲酸乙腈溶液提取，離心，上清液直接通過固相萃取柱凈化，濃縮，外標法測定。結果表明：該方法在10.0～100.0 ng·mL-1范圍內線性關系良好，r均大于0.99，檢出限為0.25 μg·kg-1，定量限為0.5 μg·kg-1;加標回收率范圍在62.3%～93.4%，相對標準偏差在1.1%～7.8%。實驗證明，該方法前處理較國標方法簡單、快捷，可為水產品中磺胺類藥物殘留的快速檢測提供方法依據。

關鍵詞：磺胺類藥物;固相萃取;水產品

Abstract：Using UPLC-MS/MS method to determine 15 kinds of sulfonamide residues in the method， a Captiva EMR-Lipid solid phase extraction column was established. The pretreatment of this method only needs to extract formic acid acetonitrile solution， centrifuge， and the supernatant is directly purified by solid phase extraction column， concentrated， and determined by external standard method. The results show that the linear relationship is good in the range of 10.0～100.0 ng·mL-1，

r is greater than 0.99， the detection limit is 0.25 μg·kg-1， the limit of quantification is 0.5 μg·kg-1; the recovery rate of standard addition ranges 62.3%～93.4%， and the relative standard deviation is 1.1%～7.8%. Experiments have proved that this method is simpler and faster than the national standard method， and can provide a method basis for the rapid detection of sulfa drug residues in aquatic products.

Key words：Sulfa drugs; Solid phase extraction; Aquatic products

中圖分類號：TS254.7

磺胺類藥物（Sulfonamides）是含有對氨基苯磺酰胺結構的一類人工合成的廣譜抗菌藥物，該類藥物種類繁多，應用廣泛[1]?；前奉愃幬锬芤种拼蠖鄶蹈锾m氏陽性菌和陰性菌，性質穩定且成本低。隨著我國水產養殖業的快速發展，為降低水產品的發病率，提高水產品的質量方面有較明顯的效果，但磺胺類藥物在動物體內代謝時間較長，易造成蓄積和殘留，食用含有磺胺類藥物的禽畜產品會對人體造成潛在的危害，有潛在的致癌性[2-4]。

目前，國家標準和行業標準中檢測磺胺類藥物的方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法、高效毛細管電泳法、酶聯免疫分析法、生物傳感器免疫分析法、高效液相色譜串聯質譜法、氣相色譜質譜法、超臨界流體色譜法和微生物法等[5]。其中，高效液相色譜串聯質譜法具有靈敏度高、選擇性強、重現性好等優勢。

水產品中還有大量蛋白質、磷脂、脂溶性色素等化合物，易造成基質效應，影響分離效果，因此需對提取樣品進行純化，減少樣品干擾。由于國家相關標準檢測磺胺類藥物的前處理方法步驟繁瑣，小柱在使用之前要活化、平衡，需要一定時間，浪費溶劑，不利于快速批量檢測。本次實驗采用Captiva EMR-Lipid固相萃取柱凈化，改進了前處理方法，優化了儀器檢測條件，該方法操作簡便，其基質干擾小、分析速度快，能有效地提高檢測時間，且節省試劑消耗，可以作為快速篩查方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Waters Xevo TQ-S Micro三重四級桿質譜儀（配有Acquity UPLC 超高效液相色譜儀及電噴霧離子源），美國Waters公司生產;SIGMA高速冷凍離心機，美國SIGMA公司生產;Milli Q超純水系統，美國Millipore公司生產;IKA刀式研磨儀、IKA旋轉蒸發儀、渦旋振蕩器，均為美國IKA公司生產;Captiva EMR-Lipid固相萃取柱，美國Agilent公司生產。

1.2 材料與試劑

15種磺胺類藥物標準品：甲氧芐啶（Trimethoprim）、

磺胺吡啶（Sulfapyridine）、磺胺噻唑（Sulfathiazole）、磺胺甲嘧啶（Sulfamerazine）、磺胺?唑（Sulfamoxole）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine）、磺胺甲氧嗪（Sulfamethoxypyridazine）、磺胺甲二唑（Sulfamethizole）、磺胺對甲氧嘧啶（Sulfamethoxydiazine）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）、磺胺多辛（Sulfadoxine）、磺胺甲?唑（Sulfamethoxazole）、磺胺異?唑（Sulfafurazole）、磺胺苯酰（Sulfabenzamide）、磺胺地索辛（Sulfadimethoxine），純度≥98%，A ChemTek Inc。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨，均為色譜純，默克公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

分別準確稱取15種磺胺類藥物標準品，用甲醇稀釋，最后用相應的空白樣品基質提取液制備混合標準工作液濃度為10.0、20.0、40.0、60.0 ng·mL-1和

100.0 ng·mL-1。

1.3.2 樣品前處理

魚肉組織先經研磨儀絞碎并使之均勻化，稱取

5 g試樣于50 mL塑料離心管中，加入2 mL水、2%甲酸乙腈4 mL，樣液渦旋混勻后，9 000 r·min-1離心10 min，收集提取液，再加入5%甲酸乙腈4 mL，同上渦旋離心，合并兩次提取液，取上清液3 mL直接通過不經活化的Captiva EMR-Lipid固相萃取柱，再用2 mL乙腈洗滌柱子，收集全部流出液，在40 ℃條件下旋蒸或者氮氣吹至近干，用10%甲醇水溶液復溶殘渣并定容至1 mL，經0.22 μm濾膜過濾，用液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件。色譜柱為Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫30 ℃;流速0.25 mL·min-1;進樣量2μL;流動相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液;梯度洗脫程序：0～1.00 min，10%A;1.01～3.00 min，10%～40%A;3.01～8.00 min，40%A;8.01～11.00 min，10%A。質譜條件。離子化模式：電噴霧離子源ESI，正離子模式;多反應監測（MRM）檢測模式;毛細管電壓1.0 kV;脫溶劑氣溫度400 ℃;脫溶劑氣流量800 L·min-1。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

磺胺類藥物（SAs）屬于兩性物質，易溶于乙腈、甲醇等有機溶劑，本實驗分別比較了0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%甲酸（含5 mmo·L-1乙酸銨溶液）-乙腈、0.1% 甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸（含5 mmol·L-1乙酸銨溶液）-甲醇流動相體系梯度洗脫對15種磺胺類藥物響應值和分離度的影響，結果顯示，使用0.1%甲酸溶液-甲醇梯度洗脫，使各組分獲得較好的分離效果，響應值最強且峰型較好。15種磺胺類藥物在此條件下的多反應監測圖如圖1所示。

2.2 質譜條件的確定

將濃度為300 ng·mL-1的15種磺胺類藥物以流動注射的方式，在正離子模式下對質譜參數毛細管電壓、錐孔電壓以及碰撞能量等進行調諧優化。15種磺胺類藥物多反應監測質譜參數優化結果見表1。

2.3 前處理條件的優化

由于磺胺類藥物很難溶于水，更易溶解于極性有機溶劑中，本實驗考察了乙腈和甲醇的提取效果。相比甲醇而言，乙腈沉淀蛋白的效果較強，選擇了乙腈作為提取溶劑，同時整個藥物處理中具有一定的弱堿性，需要借助酸性乙腈作為樣品處理溶劑，用甲酸乙腈作為提取試劑得到的色譜峰雜峰少，本實驗對比了不同濃度的甲酸乙腈，單純用2%甲酸乙腈或5%甲酸乙腈的提取效果欠佳，回收率在40%～50%。結果顯示，綜合2%甲酸乙腈和5%甲酸乙腈提取效果更佳，回收率也相對提高。

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性范圍及檢出限

本實驗采用空白基質加標制備混合標準溶液的方式，稱取5份5 g的陰性樣品，按上述前處理方法提取得到空白基質液，分別配制成濃度為10、20、40、60 ng·mL-1和100 ng·mL-1的混合標準溶液，以待測物的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標制，建立標準工作曲線。結果表明，15種磺胺類藥物在10～100 μg·L-1范圍內線性關系良好，相關系數r均在0.99以上，見表2。以3倍信噪比（S/N>3）計算檢出限為0.25 μg·kg-1，以10倍信噪比（S/N>10）計算定量限為0.5 μg·kg-1。

2.4.2 回收率和精密度

本實驗采用以未檢出待測組分的樣品做添加回收實驗，來驗證方法的準確性，在魚肉空白樣品中分別添加不同量的混合標準溶液（添加水平分別為8、10、16 μg·kg-1），每個濃度設6個平行樣，按上述優化的實驗方法測定各種磺胺類藥物的平均回收率在62.3%～93.4%，相對標準偏差（RSD）在1.1%～7.8%，滿足GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》的要求。實驗結果見表3。

3 結論

本文采用甲酸乙腈提取，CaptivaEMR-Lipid固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯質譜技術，建立了水產品中15種磺胺類藥物殘留的檢測方法。結果表明，該前處理方法快速方便，凈化步驟使得基質干擾小，本方法線性、回收率、精密度均滿足檢測要求，可用于水產品質量安全監測時大批量樣品中磺胺藥物的快速篩查。

參考文獻：

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