基于網絡藥理學的茵陳五苓散防治肝纖維化機制研究

王錚 孫明瑜

摘要?目的：通過網絡藥理學方法探索茵陳五苓散防治肝纖維化的作用機制。方法：通過TCMSP數據庫檢索茵陳五苓散的主要活性成分;通過檢索CTD數據庫選肝纖維化的疾病靶點;匹配藥物-疾病靶點，應用Cytoscape軟件構建中藥-成分-靶點網絡;運用STRING軟件構建蛋白質互作用（PPI）網絡，并將結果可視化;使用DAVID數據庫進行GO功能富集分析和KEGG通路分析。結果：獲取茵陳五苓散防治肝纖維化主要活性成分46個，作用靶點84個;網絡數據表明，茵陳的活性成分具有最大的總度值;GO功能富集分析和KEGG通路分析獲取GO條目35個，信號通路14條。結論：茵陳五苓散可能是通過Fc epsilon RI等信號通路調控IL6、TNF與PTGS2等靶點減輕炎性反應并減少細胞外基質沉積發揮抗肝纖維化作用的，而中藥茵陳與活性成分槲皮素可能在這之中發揮主要作用。

關鍵詞?網絡藥理學;茵陳五苓散;肝纖維化;經方;中醫藥

Abstract?Objective：To explore the mechanism of Yinchen Wuling Powder on liver fibrosis based on network pharmacology. Methods：The main active ingredients of Yinchen Wuling Powder was searched through TCMSP database. The disease target of liver fibrosis was searched by the CTD database; the drug-disease target was matched， Cytoscape software was used to build a traditional Chinese medicine-component-target network; STRING software was used to build a protein interaction （PPI） network， and the results were visualized; DAVID database was used perform GO function enrichment analysis and KEGG pathway analysis. Results：A total of 46 main ingredients and 84 targets of Yinchen Wuling Powder were obtained; network data indicated that active compounds of Herba Artemisiae Scopariae had the highest degree in total; and there were 35 GO terms and 14 signaling pathways in the GO and KEGG pathway analysis. Conclusion：Yinchen Wuling Powder may regulate IL6， TNF， PTGS2， etc. via pathways like Fc epsilon RI signaling pathway to reduce extracellular matrix deposition having an anti-liver fibrosis effect， and Chinese medicine Herba Artemisiae Scopariae and the active ingredient quercetin may play a major role.

Keywords?Network pharmacology; Yinchen Wuling Powder; Liver fibrosis; Classical prescription; Traditional Chinese medicine

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.003

持續的肝損傷會導致肝內膠原沉積，形成肝纖維化[1]。肝纖維化是肝硬化、肝癌等諸多重大肝病的必經病理過程[2]。然而，目前臨床上尚無注冊適應證為肝纖維化的特異性藥物[3]。但中醫藥在肝纖維化防治方面體現出獨特優勢。研究表明，經方茵陳五苓散能夠改善大鼠肝纖維化模型的肝功能以及肝組織病理[4]。茵陳五苓散出自東漢張仲景所著《金匱要略》，由茵陳與五苓散（澤瀉、茯苓、豬苓、白術與桂枝）組成，常用于治療濕重于熱型黃疸。因此，本文擬從網絡藥理學角度入手，探究茵陳五苓散防治肝纖維化的具體作用機制。

1?材料與方法

1.1?茵陳五苓散主要活性成分的篩選及作用靶點的確定?本研究通過檢索Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數據庫獲取茵陳五苓散所有化學成分，并依照數據庫推薦方法，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%&類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選標準進行篩選，得到主要活性成分[5-7]。然后，通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫繪制主要活性成分的三維結構。最后，將三維結構輸入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）軟件，通過其二維或三維結構相似性預測主要活性成分靶點[8]。

1.2?肝纖維化疾病靶點收集?通過以主題詞“Fibrosis，Liver”檢索Comparative Toxicogenomics Database（CTD，http：//ctdbase.org/），獲取目前已知的肝纖維化靶點列表[9]。

1.3?茵陳五苓散與肝纖維化靶點匹配及蛋白互作用網絡構建?將茵陳五苓散作用靶點與肝纖維化靶點逐一進行匹配，繪制Venn圖，獲取茵陳五苓散防治肝纖維化靶點列表。然后，將該列表各靶點輸入STRING v11（https：//string-db.org/）軟件，將Organism參數設置為“homo sapiens”，構建蛋白互作用（Protein-protein Interactions，PPI）網絡，并將該網絡導入Cytoscape v3.8.0軟件進行繪圖[10-11]。

1.4?中藥-成分-靶點網絡構建?逐一匹配中藥-成分-靶點關系，并將列表導入Cytoscape軟件構建網絡，進行繪圖，確定網絡節點、邊、度值等參數。

1.5?GO分析與KEGG通路分析?將靶點列表輸入Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery v6.8（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）數據庫，進行基因本體學（Gene Ontology，GO）與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析[12-13]。

2?結果

2.1?茵陳五苓散主要活性成分的篩選及作用靶點?本研究通過檢索TCMSP數據庫并進行篩選后，共獲取茵陳五苓散活性成分46個，茵陳含有其中14個，澤瀉含有8個，茯苓含有15個，豬苓含有10個，桂枝含有7個，白術含有7個，存在2種中藥共有相同成分的情況。見表1。經過二維與三維結構比對，預測茵陳五苓散存在藥物靶點共521個。

2.2?肝纖維化的疾病靶點篩選?在CTD數據庫中共檢索到肝纖維化相關靶點共1 029個。去重后，共得到955個肝纖維化相關靶點。

2.3?共同靶點篩選及互作網絡構建?通過繪制Venn圖，獲取茵陳五苓散與肝纖維化交集靶點84個。見圖1。然后，對此84個靶點構建PPI網絡。見圖2。此網絡中，每個節點代表一個靶點，每條邊代表一項靶點間互作用關系。此外，度值最高的3個節點分別為IL6（度值57）、TNF（度值49）與PTGS2（度值38）。見圖3。度值能夠表示一個節點在其所在網絡的重要性。

2.4?中藥-成分-靶點網絡?對茵陳五苓散組成中藥、所含主要活性成分與對應靶點進行網絡構筑。見圖4。其中紫色節點代表茵陳五苓散組成中藥，紅色節點代表主要活性成分，藍色節點代表對應靶點。此網絡中度值最高的3個主要活性成分分別為Cerevisterin（啤酒甾醇，度值34）、Ergosterol Peroxide（過氧麥角甾醇，度值30）與6-demethoxycapillarisin（6-去甲氧基茵陳色原酮，度值25）;度值最高的3個對應靶點分別為PTPN1（度值35），CYP17A1（度值31）與HMGCR（度值28）。見圖5。此外，計算表明，在茵陳五苓散中，茵陳的活性成分具有最高的總度值。同時，在各個中藥的活性成分中，Quercetin（槲皮素）與重要靶點對接次數最多。

2.5?GO分析與KEGG通路分析?應用DAVID v6.8進行GO與KEGG通路富集分析，并進行可視化。GO分析獲取GO條目35個，其中生物過程（Biological Process，BP）的主要條目為蛋白質水解（Proteolysis）、氧化還原過程（Oxidation-reduction Process）、炎性反應（Inflammatory Response）等，細胞組分（Cellular Component，CC）的主要條目為漿膜（Plasma Membrane）、細胞外外泌體（Extracellular Exosome）、細胞外間隙（Extracellular Space）等，分子功能（Molecular Function）的主要條目為受體結合（Receptor Binding）、酶結合（Enzyme Binding）、絲氨酸類型內肽酶活性（Serine-type Endopeptidase Activity）等。見圖6A。KEGG通路分析獲取信號轉導通路14條，主要信號通路為Fc epsilon RI信號通路、TNF信號通路、Sphingolipid信號通路、Rap1信號通路等。見圖6B、圖7，表2。

3?討論

現代研究表明，茵陳五苓散能夠保肝利膽、降血脂與抗動脈粥樣硬化，同時也具有抗過敏、抗炎、鎮痛，在肝炎、高血脂與痛風性關節炎等作用[14]。此外，也有研究表明茵陳五苓散具有抗肝纖維化潛力[4]。因此，本文通過網絡藥理學方法對其抗肝纖維化的可能機制進行了探索。

中藥復方成分復雜。本研究通過數據庫篩選已發現的茵陳五苓散成分，獲取易于人體利用的成分46個。在后續的實驗中，相繼發現這些成分的作用靶點521個，以及潛在的抗肝纖維化靶點84個。

在PPI分析中，重要的靶點有IL-6、TNF與PTGS2等。IL（interleukin，白細胞介素）-6是一種重要的細胞因子，能夠調控細胞的增殖、分化與特異性基因的表達，并且在肝纖維化中發揮重要作用[15]。IL-6通過Fas通路促進肝星狀細胞的活化，導致細胞外基質過度沉積，加重肝纖維化程度[16]。TNF（tumor necrosis factor，腫瘤壞死因子）-α是巨噬細胞等免疫細胞分泌的多效性細胞因子，能夠促進炎性反應的發生發展[17]。而炎性反應的存在會導致過度的肝再生，分泌過剩的細胞外基質，從而加重肝纖維化。PTGS2，其編碼蛋白COX（cyclooxygenase，環氧化酶）-2屬于誘導型酶，在受到各種刺激的情況下才會發生誘導表達。而COX-2抑制劑能夠通過抑制這個途徑參與炎性反應、細胞增殖、血管增生等纖維化相關生理病理過程[18]。因此，茵陳五苓散可能是通過調節對應靶點改善肝臟炎性反應以發揮其抗纖維化效果的。

值得注意的是，在茵陳五苓散中，茵陳的活性成分具有最高的總度值，這提示在此方劑中，茵陳可能發揮主要作用。茵陳本身具有顯著抗肝纖維化作用，其能夠改善大鼠血清丙二醛與肝羥脯氨酸水平[19]。此外，茵陳具有良好的抗炎作用，其能夠抑制COX-2活性，組織巨噬細胞產生活性氧。也有研究表明，茵陳也能通過下調TLR4抑制NF-κB信號通路，從而發揮其抗炎作用[19]。同時，與關鍵靶點對接次數最多的活性成分為槲皮素。既往研究發現，槲皮素能夠通過調節TGF-β1/Smads與PI3K/Akt通路抑制肝星狀細胞激活并減少其自噬作用發揮抗肝纖維化作用[20]。此外，槲皮素在多種纖維化疾病中均有一定防治作用[21-23]。

GO分析也表明，茵陳五苓散靶點與炎性反應、細胞外外泌體、細胞外間隙、受體結合等條目相關。乙醇、肝炎病毒等對肝臟造成損傷后，肝臟會啟動名為肝再生的損傷修復[1]。這一過程中，活化的肝星狀細胞會分泌細胞外基質以修復受損的肝臟。若病因持續存在，細胞外基質則會分泌過剩，造成膠原沉積，引起肝纖維化[24-25]。因此GO分析結果能夠在一定程度上驗證茵陳五苓散防治肝纖維化的有效性，并較為明確地指出了其具體作用環節與位置。

KEGG通路分析結果提示茵陳五苓散防治肝纖維化作用機制與Fc epsilon RI信號通路相關。茵陳五苓散可能參與調控該通路中Fyn、Vav、p38、cPLA2等節點。這一通路參與調控IL-3、4、5、13等多種細胞因子，并與花生四烯酸代謝、MAPK信號通路等密切相關，而這些細胞因子與通路均在肝纖維化以及相關炎性反應中發揮重要作用[26-28]。

綜上所述，茵陳五苓散具有防治肝纖維化的潛力，其具體機制可能是通過減輕肝臟炎性反應并減少細胞外基質分泌從而發揮其抗纖維化作用。其中發揮主要防治作用的中藥與活性成分可能為茵陳與槲皮素。

本文采用網絡藥理學方法，初步探索了茵陳五苓散防治肝纖維化的有效活性成分、關鍵靶點、作用機制及可能通路。結果顯示，茵陳五苓散可能通過Fc epsilon RI等信號通路調控IL-6、TNF與PTGS2等靶點，減輕炎性反應并減少細胞外基質分泌發揮其抗肝纖維化作用，提示茵陳五苓散具有作為防治肝纖維化藥物的潛力。而在茵陳五苓散中，中藥茵陳以及活性成分槲皮素可能發揮主要作用，因此，槲皮素有望以單體的形式成為肝纖維化的防治藥物。本文研究結果具有局限性，需要動物及臨床試驗驗證其有效性與可靠性。

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（2020-09-10收稿?責任編輯：王明）