不同生境下多花黃精化學成分比較

倪天宇，羅曉朦，張春椿，俞 冰，張水利，范慧艷

（浙江中醫藥大學藥學院，浙江杭州 310053）

多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua為百合科黃精屬植物,是一種重要的野生中藥資源,與滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricumRed.一同收錄于2015年版《中國藥典》 一部［1］,為我國傳統大宗藥食同源的中藥材。多花黃精主產于湖南、貴州、安徽、浙江、福建等省,生林下、灌叢或山坡陰處［2］,其味甘,平,歸脾、肺、腎經,具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎等功效［1］?，F代藥理研究表明,黃精具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調節、改善記憶障礙、保護腎功能等多種藥理作用［3-7］。近年來,由于市場對黃精需求量的增加,引發藥農掠奪性地采挖,導致野生多花黃精資源量驟減,已經不能滿足市場需求。目前,許多學者對多花黃精的林下栽培技術模式進行研究,主要為毛竹林、杉木林及不同郁閉度坡向坡位對多花黃精生長量的影響［8-11］,但尚未見不同生境下多花黃精主要化學成分比較的報道。因此,本實驗探討了不同野生與人工種植生境下多花黃精折干率、浸出物、黃精多糖、總黃酮、總皂苷、總酚的變化規律,探索種植生境與藥材產量、品質間的關系,以期為多花黃精規范種植提供理論依據。

1 材料

中藥粉碎機（上海淀久中藥機械制造有限公司）；MS105DU電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；DHG-2150B電熱鼓風干燥箱（鄭州生元儀器有限公司）；G-060S超聲波清洗機（深圳市歌能清洗設備有限公司）；RE52-AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；HH420電熱恒溫水浴槽（上虞道墟茂祥儀器設備廠）；752N紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

無水葡萄糖對照品（批號20141211,上海強順化學試劑有限公司）；蘆丁 （批號100080-200707）、人參皂苷Rb1（批號110704-200420）、沒食子酸對照品（批號110831-201204）,均購于中國食品藥品檢定研究院；福林酚（上海源葉生物科技有限公司）；蒽酮（上海展云化工有限公司）；硫酸 （西隴科學股份有限公司）；高氯酸（國藥集團化學試劑有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁（上海振欣試劑廠）；氫氧化鈉、無水乙醇、乙酸、香草醛（天津市科密歐化學試劑有限公司）等均為分析純。

35批樣品于2017年10至11月從浙江金華、麗水采集,經浙江中醫藥大學藥學院俞冰副教授鑒定為百合科植物多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua的根莖,生長年限均為3年,樣品信息見表1。其中針闊混交林、毛竹林、常綠闊葉林3種生境下的樣品均為野外采收（無人工干預的野生環境）,大田及錐栗林為人工種植。

2 方法

2.1 折干率、浸出物及黃精多糖含有量測定 樣品采收后除去須根、洗凈,晾干表面水分后切成薄片,準確稱定其鮮重,置于烘箱中105 ℃殺青30 min,60 ℃烘干至恒定質量,取出,降至室溫后稱定質量,計算折干率。

黃精多糖和浸出物含有量的測定參照2015年版《中國藥典》 一部［1］和四部［12］中的方法,各組重復測定3次。以無水葡萄糖對照品質量濃度為橫坐標（X）,吸光度為縱坐標（Y）,進行回歸,得回歸方程為Y=39.252X+0.026 7 （r=0.999 5）,在0.003 4～0.020 4 mg/mL范圍內線性關系良好。精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗RSD分別為1.09%、1.74%、1.92%；平均加樣回收率99.81%,RSD 0.98% （n=9）。

2.2 總黃酮含有量測定

2.2.1 方法學考察 精密稱取蘆丁對照品40 mg,用50%乙醇超聲溶解,轉移至100 mL量瓶中并定容,充分搖勻,備用。分別吸取蘆丁對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL量瓶中,然后加入0.3 mL 5%NaNO2,搖勻,靜置6 min,再加入0.3 mL 10%Al （NO3）3,搖勻,靜置6 min,最后加入2 mL 4%NaOH,以50%乙醇定容,靜置15 min,以空白試劑作對照,在510 nm處測定吸光度。以對照品質量濃度為橫坐標（X）,吸光度為縱坐標（Y）,得回歸方程為Y=9.530 2X-0.013 9 （r=0.999 8）,在0.004 1～0.041 0 mg/mL范圍內線性關系良好。精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗RSD分別為1.10%、1.96%、1.56%；加樣回收率 99.40%,RSD 1.45%（n=9）。

2.2.2 樣品總黃酮含有量測定 精密稱取多花黃精粉末1.5 g,平行3份,分別置于20 mL具塞試管中,加入15 mL 50% 的乙醇溶液（加入1% 鹽酸）,超聲（360 W,40 kHz）提取1 h,濾過,濾液用50%乙醇定容至25 mL。精密吸取0.3 mL,按“2.2.1” 項下方法測定和計算多花黃精總黃酮的含有量［13］。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.3 總皂苷含有量測定

2.3.1 方法學考察 精密稱取人參皂苷Rb1對照品10 mg,置10 mL量瓶中,加無水甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,備用。分別量取人參皂苷Rb1對照品溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL,置于具塞刻度試管中,揮盡溶液,加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液（現配）及0.8 mL高氯酸,搖勻,置于60 ℃水浴加熱15 min后,冰浴2 min,再加入5 mL冰醋酸,搖勻,靜置5 min。以相應的試劑為空白,照紫外-可分光光度法,在568 nm波長處測定吸光度。以對照品質量濃度為橫坐標（X）,吸光度為縱坐標（Y）,進行回歸,得回歸方程為Y=16.507X+0.024 6 （r=0.999 0）,在0.009 6～0.067 2 mg/mL范圍內線性關系良好。精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗RSD分別為1.34%、1.97%、1.99%；加樣回收率98.01%,RSD 1.70% （n=9）。

2.3.2 樣品總皂苷含有量測定 精密稱取多花黃精粉末1.0 g,平行3份,分別加入80% 乙醇15 mL,60 ℃超聲提取50 min,重復提取2次,合并濾液至50 mL量瓶中,加入80% 乙醇定容。精密吸取0.1 mL,按“2.3.1” 項下方法測定和計算多花黃精總皂苷含有量［14］。

2.4 總酚含有量測定

2.4.1 方法學考察 精密稱取沒食子酸對照品13 mg,置于50 mL量瓶中,加入20 mL 70%乙醇,超聲使其充分溶解,用70%乙醇定容,搖勻備用。分別取沒食子酸對照品溶液20、40、60、80、100、120 μL置于5 mL量瓶中,依次加入3.2 mL蒸餾水,福林酚顯色劑200 μL,充分振蕩后靜置6～8 min,加入15% Na2CO3溶液500 μL,搖勻,在室溫下避光放置反應2 h,在765 nm波長處測定吸光度。以對照品質量濃度為橫坐標（X）,吸光度為縱坐標（Y）,進行回歸,得回歸方程為Y=77.945X+0.022 7 （r=0.999 2）,在0.001 1～0.006 4 mg/mL范圍內線性關系良好。精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗RSD分別為0.99%、1.99%、1.87%；加樣回收率 100.51%,RSD 1.77% （n=9）。

2.4.2 樣品總酚含有量測定 精確稱取多花黃精粉末1.0 g,平行3份,分別置于試管中,加入10 mL 70% 乙醇,超聲 （360 W,40 kHz）提取30 min,濾過,取濾液,反復提取3次。合并濾液旋干,并用70% 乙醇定容至50 mL。精密吸取100 μL,按“2.4.1” 項下方法測定和計算多花黃精總酚含有量［13］。

2.5 統計分析 采用Excel 2010和SPSS 25.0統計軟件對所測定的數據進行整理分析；采用單因素方差分析比較不同生境下多花黃精的折干率、浸出物、多糖、黃酮、皂苷、總酚含有量的差異；利用相關性分析分析各檢測指標之間的相關性；采用主成分分析評價各生境下多花黃精品質的優劣。

3 結果

3.1 折干率比較 折干率是指藥材干燥前后質量之比,是衡量藥材產率的重要指標,折干率越大,藥材得率越高。由表2可知,針闊混交林生境下多花黃精折干率與毛竹林、常綠闊葉林、錐栗林生境均存在統計學差異（P＜0.05）,毛竹林與大田、常綠闊葉林生境差異有統計學意義（P＜0.05）,人工種植的大田與錐栗林模式樣品折干率亦存在統計學差異（P＜0.05）。折干率均值由大到小依次為毛竹林、錐栗林、常綠闊葉林、大田、針闊混交林。

3.2 浸出物比較 不同生境下多花黃精醇溶性浸出物測定結果見表2,錐栗林生境下醇溶性浸出物最高,針闊混交林生境下醇溶性浸出物最低,分別為72.93%、63.40%,各生境下浸出物含有量均高于2015年版《中國藥典》 規定的不得少于45%的標準［1］。方差分析結果表明,人工種植下的錐栗林生境中樣品的浸出物含有量與針闊混交林、毛竹林、大田生境均存在統計學差異（P＜0.05）。浸出物均值由大到小依次為錐栗林、常綠闊葉林、毛竹林、大田、針闊混交林。

3.3 黃精多糖比較 黃精多糖是黃精的一種重要活性成分,其含有量被2015年版《中國藥典》 列為多花黃精的質量考察指標,根據藥典要求,黃精多糖含有量≥7%為符合標準［1］。由表2可知,不同生境下黃精多糖含有量在5.35%～7.18%范圍之間,僅錐栗林生境下的樣品達到藥典標準。經單因素方差分析,針闊混交林生境下黃精多糖含有量與毛竹林、錐栗林均存在統計學差異（P＜0.05）。各生境黃精多糖均值由大到小依次為錐栗林、毛竹林、常綠闊葉林、大田、針闊混交林。

3.4 總黃酮比較 多花黃精含有天然高異黃酮類化合物［15］,由表2可知,不同生境下多花黃精總黃酮含有量在9.37～12.53 mg/g之間。其中,大田生境下最高,針闊混交林生境下最低,大田比針闊混交林、毛竹林、常綠闊葉林、錐栗林分別高出3.16、2.85、2.09、2.11 mg/g。方差分析可知,不同生境類型下多花黃精總黃酮含有量差異無統計學意義（P＞0.05）。各生境下樣品總黃酮均值由大到小依次為大田、常綠闊葉林、錐栗林、毛竹林、針闊混交林。

3.5 總皂苷比較 各生境下多花黃精總皂苷含有量測定結果見表2,其總皂苷含有量在25.78～84.98 mg/g范圍之間。方差分析結果表明,錐栗林生境下總皂苷含有量高于其余4種生境（P＜0.05）,為84.98 mg/g；毛竹林、常綠闊葉林生境總皂苷含有量均高于大田模式（P＜0.05）,分別為51.96、52.84 mg/g；大田和針闊混交林生境無統計學差異（P＞0.05）,分別為25.78、38.28 mg/g。各生境下樣品總皂苷均值由大到小依次為錐栗林、常綠闊葉林、毛竹林、針闊混交林、大田。

3.6 總酚比較 由表2可知,不同生境下多花黃精總酚含有量在0.56～1.67 mg/g之間。其中,毛竹林生境下最高,常綠闊葉林生境下最低,毛竹林比針闊混交林、常綠闊葉林、大田、錐栗林分別高出0.55、1.11、0.70、0.47 mg/g。經單因素方差分析,不同生境類型下多花黃精總酚含有量無統計學差異（P＞0.05）。各生境下樣品總酚均值由大到小依次為毛竹林、錐栗林、針闊混交林、大田、常綠闊葉林。

表2 不同生境下多花黃精化學成分含有量比較Tab.2 Content comparison of chemical constituents of P.cyrtonemain different growing areas

3.7 相關性分析 相關性分析見表3。各檢測指標之間相關性顯著,不互相獨立。多花黃精折干率與總皂苷呈正相關（P＜0.01）,浸出物與總皂苷呈正相關（P＜0.05）。相關性分析表明,折干率與主要化學成分含有量均呈正相關,這與陳怡等［16］報道一致,折干率可以從側面反映各部分水分和干物質儲存狀況,折干率較大,表明生長代謝活躍。

表3 多花黃精各評價指標相關性分析Tab.3 Correlation analysis of chemical constituents in P.cyrtonema

3.8 主成分分析 為比較不同生境下多花黃精品質的優劣,采用SPSS 25.0軟件對所測指標進行主成分分析。由表4可知,當主成分個數達到3時,主成分累計貢獻率為72.426%,其中第1主成分貢獻率最大,達35.498%。用3個主成分對不同生境下的多花黃精進行綜合評價,其綜合評價函數為F=0.490F1+0.276F2+0.234F3,可知,F1對綜合評分的影響最大,其中多花黃精的折干率、浸出物、黃精多糖和總皂苷在第1主成分上有較高載荷,見表5,表明上述4個指標對于多花黃精的品質影響較大。通過上述綜合評價函數計算各生境下樣品的綜合得分,結果見表6。各生境下多花黃精綜合得分由大到小依次為錐栗林、毛竹林、常綠闊葉林、大田、針闊混交林。

4 討論

生境類型是影響多花黃精生長和次生代謝物累積的因子之一［17］。本研究發現,不同生境下多花黃精的折干率、浸出物含有量、黃精多糖以及總皂苷含有量的差異較大。2種人工種植模式中,錐栗林生境下多花黃精的品質優于大田生境。由于多花黃精生長期喜陰濕潤涼,不耐高溫［18］,適當遮蔭可促進其生長,但過度遮蔭反而會抑制其根莖生長［19］。錐栗林生境較大田而言,增加了錐栗的遮蔭,為林下種植的多花黃精構造出相對陰濕的環境,更適宜其生長,因此,錐栗林生境下產出的多花黃精品質更優。黃精多糖及浸出物含有量被2015年版《中國藥典》 列為黃精藥材的質量考察指標,根據藥典要求,黃精多糖含有量≥7%,浸出物≥45%為符合標準［1］,因此僅錐栗林生境下的多花黃精達到藥典標準,其余樣品均低于藥典標準。

表4 主成分分析特征值Tab.4 Eigenvalues of principal component analysis

表5 各成分主成分特征向量Tab.5 Eigenvectors of the principal components of various constituents

表6 不同生境下多花黃精綜合得分與排名Tab.6 Comprehensive score and ranking of P.cyrtonemafrom different growing areas

3種野生生境中,毛竹林生境下多花黃精的品質最優,常綠闊葉林生境次之,針闊混交林排名最末。3種野生生境的物種組成、林分結構、多樣性等均存在差異,這些因素均可對多花黃精的品質產生影響。常綠闊葉林和針闊混交林群落物種組成豐富、多樣性指數高,林分生物量、掉落物均顯著高于毛竹林［20］。因此在沒有人工干預的情況下,可能形成了過度遮蔭的效果,影響了多花黃精次生代謝產物的積累,同時豐富的群落物種也極易與多花黃精形成群落內的種間競爭。而毛竹林是上述生境中,結構最簡單、林中物種組成最少、多樣性最差的群落類型［20］,種間競爭壓力小,且其遮蔭度可能正好適合多花黃精的生長,結果導致毛竹林生境下多花黃精品質要優于常綠闊葉林和針闊混交林。

人工種植的錐栗林下多花黃精的品質優于野生的毛竹林,錐栗與多花黃精的林下復合種植,為多花黃精構造出相對陰濕的環境,且通過人工措施干預,調控了林分的郁閉度和群落的物種量,適度遮蔭的同時,減少了野外環境中存在的群落內種間競爭,保證了錐栗林生境下多花黃精藥材的品質。錐栗林生境下多花黃精的浸出物、黃精多糖以及總皂苷含有量均為最高,折干率和總酚僅次于毛竹林生境,總黃酮含有量位列第三,通過主成分分析可知,5種不同類型生境中,以錐栗林生境下種植的多花黃精品質最佳。多花黃精在錐栗林下的種植模式屬于典型的林藥間作模式,它將適宜在林下生長、具有一定耐蔭性的藥用植物引種到林下進行栽培,不僅種植的多花黃精品質優異,還可充分利用土地資源,獲得更高的社會經濟利益和生態效益［21］,錐栗與多花黃精的林下復合種植模式值得推廣。