黃柏生品與鹽炙品中生物堿類成分在大鼠腎組織臟器中的吸收差異

張 凡 孟 莉 劉蓬蓬王 旭王 銳宋 成賈天柱*

（1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧大連 116600）

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮。其味苦,性寒,歸腎、膀胱、大腸經,具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效,為中醫傳統的清熱燥濕藥［1］?！侗静菥V目》 載有“黃檗性寒而沉,生用則降實火,熟用則不傷胃,酒炙則治上,鹽炙則治下,蜜炙則治中”。這是對黃柏炮制作用最精辟的論述。生黃柏具苦寒之性,清熱燥濕作用強,酒炙緩和苦寒之性,而鹽炙則增強苦寒之性,又引藥下行入腎,還可增強滋陰降火的作用。此外在其他醫書中,針對黃柏的鹽炙也有相關的記載。黃柏經鹽炙后可引藥下行入腎,其滋腎陰、瀉腎火、退虛熱的功效增強,可用于陰虛發熱、夢遺滑精、骨蒸勞熱、盜汗、咳嗽咯血等證。而目前黃柏的“鹽炙入腎”的炮制理論仍然停留在傳統表述之中,并無現代科研數據支撐。本實驗通過大鼠腎組織中對黃柏有效成分的吸收差異,對其“鹽炙入腎” 的理論進行驗證［2］。

黃柏中富含生物堿類及少部分檸檬苦素類成分,其中生物堿類包含小檗堿、黃柏堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿等,這些都是黃柏中具有代表性的活性成分,具有清熱、抗炎、降血壓等功效［3］。此外,除生物堿成分,黃柏還含有少量的檸檬苦素類成分,如黃柏酮和黃柏內酯等［4］。本實驗擬通過對黃柏生品及鹽炙品的水煎液進行大鼠灌胃給藥后,并分別在不同時間點摘取其腎組織,采用液質聯用的方法對腎組織臟器中生物堿類成分進行含有量測定,從而分析黃柏生制品在腎組織臟器的吸收差異。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQD超高效液相色譜串聯飛行質譜儀 （美國Waters公司）；METTLER AE240型分析天平（十萬分之一,瑞士Mettler公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）；FSH-2可調高速電動勻漿器（江蘇佳美儀器有限公司）；XW-80A渦旋混合器 （上海青浦滬西儀器廠）；Thermo Fisher Finnpipette Steppers單道連續分配移液器（芬蘭雷勃公司）；HGC-12A氮吹儀（天津恒奧科技有限公司）；Milli-Q純水儀（德國Millipore公司）。

1.2 試劑與藥物 黃柏堿、木蘭花堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、尼莫地平對照品（大連美倫生物技術有限公司,批號分別為M0107AS、M0717AS、B0613AS、S0913AS、J0918AS、M0503AS）；質譜級甲醇、乙腈、色譜級甲醇（美國Sigma公司）；水為超純水,無碘鹽（大連鹽業有限公司）；其他試劑均為高級分析純。

1.3 藥材 黃柏藥材采自四川省雅安市滎經縣,經遼寧中醫藥大學王冰教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮。

2 方法

2.1 實驗動物 SD雄性大鼠66只,體質量180～200 g,6～8周齡,遼寧長生生物技術有限公司提供,許可證號SCXK （遼）2010-0001。在正式實驗前,大鼠適應性喂養一周,預飼養期間自由飲食飲水,室溫（22±2）℃,濕度（60±2）%。

2.2 黃柏生制炮制制備

2.2.1 生黃柏制備 取黃柏原藥材,洗凈,潤透,切細絲,干燥,既得。

2.2.2 鹽黃柏制備 取凈制后的黃柏絲,放入適宜的容器中,加適量鹽水拌勻,悶潤2 h,待黃柏吸進輔料鹽水后取出。在炒制容器內于150～160 ℃下,炒制6 min,取出,放涼,即得。每100 g黃柏加2 g鹽,30%蒸餾水［5］。

2.3 給藥水煎液制備 分別取黃柏生品和鹽炙品適量置于煎藥鍋中,先加入10倍量水浸泡30 min,而后煎煮60 min,濾過；此后藥渣再加入8倍量水,再次煎煮60 min,濾過。合并2次濾液,水浴濃縮至質量濃度為1 g/mL［6-7］。

2.4 給藥方案及樣品采集 66只大鼠隨機分成2組,分別為生黃柏組30只,鹽黃柏組30只,空白組6只。各組給藥體積為10 mL/kg,灌胃給予相應黃柏炮制品藥液。分別于0.5、1、3、6、9 h時間點上,每組脫頸椎處死6只動物,立即取出腎臟組織,生理鹽水沖洗干凈,用濾紙吸干表層水分,分裝于自封袋中,置-80 ℃冰箱中保存待測。

2.5 溶液制備

2.5.1 對照品溶液 精密稱取黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿對照品適量,置50 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制備成質量濃度分別為74.8 μg/mL的黃柏堿、63.4 μg/mL的黃柏堿、63.2 μg/mL的藥根堿、60.1 μg/mL的巴馬汀、61.2 μg/mL的小檗堿對照品貯備液,置于冰箱中4 ℃保存備用。

2.5.2 內標溶液 精密稱取尼莫地平對照品適量,置50 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制備成質量濃度為5.0 μg/mL的內標溶液,并置于4 ℃的環境中保存備用。

2.6 腎組織樣品處理 精密稱量腎組織樣品200 mg,剪碎后,加入2 mL生理鹽水,用組織勻漿機處理。之后以4 000 r/m離心,取上清組織勻漿液100 μL,加內標溶液10 μL,渦旋混合30 s,再加入乙腈400 μL,渦旋混合180 s,12 000 r/m離心10 min后,取上清液。將上清溶液,于35 ℃氮氣吹干,殘渣加入乙腈-水（1 ∶1）混合溶液100 μL復溶,渦旋混勻3 min進行混勻,最后以12 000 r/m冷凍離心5 min,取上清液5 μL進樣分析［8-9］。

2.7 分析條件

2.7.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm,1.7 μm）；流動相0.1% 甲酸水（A）-0.1% 甲酸乙腈（B）,梯度洗脫,程序見表1；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.7.2 質譜條件 采用ESI源；正離子MRM模式檢測；離子源能量3.0 kV,采樣錐電壓50 V,離子源溫度150 ℃,脫溶劑溫度450 ℃；錐孔氣體體積流量50 L/h,脫溶劑氣體體積流量900 L/h。

2.8 分析方法確證

2.8.1 專屬性試驗 黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿和內標物尼莫地平成分在ESI正離子電離方式下,主要生成［M+H］+離子峰,分別為m/z342.17,m/z342.18,m/z338.15,m/z352.15,m/z336.07,m/z419.21。選擇性對［M+H］+離子進行產物離子全掃描質譜分析,上述指標性成分和內標物的主要碎片離子分別為m/z192.15,m/z265.16,m/z323.03,m/z336.20,m/z320.29,m/z343.17,并將這些主要碎片離子作為定量分析時監測的產物離子（MRM模式）,各檢測成分的母離子和產物離子見表2。

表2 MRM模式下各檢測成分和內標物的母離子和產物離子Tab.2 Optimized multiple reaction monitoring parameters for analytes and internal standard

分別取大鼠空白腎臟組織勻漿液及給藥后腎組織樣品100 μL,按“2.6” 項下方法操作,得到MRM色譜圖,見圖1。由圖可見,黃柏給藥后指標性成分和內標物成分出峰保留時間分別為黃柏堿1.02 min、木蘭花堿1.10 min、藥根堿2.42 min、巴馬汀3.69 min、小檗堿4.15 min、尼莫地平7.05 min,各組分色譜峰之間分離良好,表明組織中內源性物質對所測定成分無干擾［10-11］。

圖1 黃柏中生物堿及內標物生物樣品質譜TIC圖Fig.1 TIC spectrum of alkaloids and internal standard biological samples in P.chinense

2.8.2 線性關系及定量下限

2.8.2.1 線性關系考察 取大鼠空白腎臟組織勻漿液100 μL,加內標溶液和黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿系列溶液,分別制備成黃柏堿組織質量濃度分別為3.74、7.48、14.96、24.93、59.88、119.76、239.51、437.03 ng/mL；木蘭花堿組織質量濃度分別為15.85、31.70、63.40、126.80、253.60、507.20、1 014.40、2 028.80 ng/mL；藥根堿組織質量濃度分別為15.80、31.6、63.20、126.40、252.80、505.60、1 011.20、2 022.40 ng/mL；巴馬汀組織質量濃度分別為15.02、30.04、60.08、120.16、240.32、480.64、961.28、1 922.56 ng/mL；小檗堿組織質量濃度分別為15.30、30.60、61.20、122.40、244.80、489.60、979.20、1 958.4 ng/mL；內標尼莫地平溶液質量濃度相當于500 ng/mL的標準樣品,按“2.6” 項下方法處理,記錄色譜圖；以待測物指標性成分質量濃度為橫坐標（X）,待測物與內標物的面積比為縱坐標（Y）,用加權（w=1/x2）最小二乘法進行回歸運算,求得直線回歸方程,結果表明各成分在各自范圍內線性關系良好。結果見表3。

2.8.2.2 定量下限 取大鼠空白腎臟組織勻漿液100 μL,加入對照品溶液制備成3.74 ng/mL黃柏堿、15.85 ng/mL木蘭花堿、15.80 ng/mL藥根堿、15.02 ng/mL巴馬汀、15.30 ng/mL小檗堿溶液,按“2.6” 方法操作,并根據當日標準曲線計算每一樣本測得濃度,考察定量下限。結果見表3。發現上述各濃度對照品的準確度偏差在±20% 以內,精密度RSD≤15%［12］。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.8.3 精密度和準確度試驗 取空白腎組織勻漿樣品100 μL,按“2.8.2” 項下方法制備低、中、高3個濃度的質量控制樣品,每一濃度平行分析6份,連續測定3 d,根據質量控制樣品測定的結果計算本方法的準確度與精密度,結果表明,樣品日內、日間精密度RSD均小于15%,準確度均在±15%的范圍之間,表明該方法準確度與精密度良好。

2.8.4 提取回收率和和基質效應

2.8.4.1 提取回收率 取空白腎組織勻漿液100 μL,按 “2.8.3” 項下方法操作,制備低、中、高3個濃度的質量控制樣品,每個濃度平行測定6份,記錄色譜峰,測定各組分和內標物的峰面積記為A。同時另取空白腎組織勻漿液100 μL,除不加內標物溶液外,其余按“2.6” 項下方法操作所得殘渣加入各組分對照品溶液和內標物溶液,并在35 ℃氮氣流吹干后,再用乙腈-水（1 ∶1）溶液復溶,渦旋充分混合,離心后取上清液進樣分析,每個濃度平行制備6份,記錄色譜圖。測量各組分和內標物的峰面積記為B。以前種處理方法所得的峰面積A與后種處理方法獲得的峰面積B均值分別計算藥物的和內標物的提取回收率。結果見表4。

2.8.4.2 基質效應 取各組分標準溶液和內標物溶液,置于EP管中,35 ℃下氮氣流吹干后用乙腈-水（1 ∶1）溶液溶解殘渣,渦旋混合,離心后取上清液進樣分析,每個濃度3個樣本,記錄色譜圖,測定各組分色譜峰面積和內標物峰面積為C。以“2.8.4.1” 項下所得峰面積B,與峰面積C均值的比值分別計算各組分和內標物的基質效應。結果見表4。結果表明各組分和內標物不存在明顯的離子抑制或離子增強現象［13］。

2.8.5 穩定性試驗 按“2.8.3” 項下方法制備各組分的低、中、高3個濃度的質量控制溶液,每一濃度平行3份。按“2.6” 項下方法,經過室溫6 h,-80 ℃保存14 d,3個凍融循環后測定其濃度,實驗結果表明,所測的各組分在大鼠腎組織樣品中穩定性均在±15%范圍之間,表明本實驗的生物樣品相對穩定。

3 結果

大鼠灌胃給予生黃柏和鹽黃柏水煎液后,在不同時刻摘取大鼠腎組織臟器,采用UPLC-QqQ-MS法對腎組織中的生物堿類組分的濃度進行測定,結果見表5。

表4 各檢測組分的提取回收率和基質效應（n=6）Tab.4 Extraction recovery and matrix effects and for the analytes in rats kidney tissue （n=6）

表5 大鼠給予生制黃柏后腎組織中各檢測組分質量濃度（ng/mL，， n=6）Tab.5 Concentrations of each analytes in rats kidney tissue after oral administration of raw and processed P.chinense（ng/mL，， n=6）

表5 大鼠給予生制黃柏后腎組織中各檢測組分質量濃度（ng/mL，， n=6）Tab.5 Concentrations of each analytes in rats kidney tissue after oral administration of raw and processed P.chinense（ng/mL，， n=6）

表5顯示,大多數生物堿成分的含有量,在大鼠灌胃給藥后,隨著時間推移,其濃度逐漸降低,而少部分生物堿如巴馬汀和小檗堿在灌胃給藥約6 h后,其濃度又有小幅升高,推測黃柏生物堿成分在大鼠體內的吸收可能存在肝腸循環［14-17］。此外,同一檢測組分,在同一給藥時間后,鹽黃柏相對于生黃柏在大鼠腎組織臟器中的生物堿含藥濃度較高,表明鹽炙后各組分有增強趨向腎組織作用效果。

4 討論

黃柏作為鹽炙品種的代表中藥之一,其經過鹽炙之后可以引藥下行入腎,增強了滋腎陰、瀉腎火、退虛熱的作用。結果表明,黃柏中的生物堿類成分黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀以及小檗堿類,在黃柏鹽炙之后,同一給藥時間后,其大多數都是鹽炙品中的生物堿濃度高于生品中的生物堿,從而表明黃柏經過鹽炙之后,生物堿類成分更加趨向于腎組織臟器的分布,進而治療腎臟相關的疾病。前期實驗,課題組復制了腎陰虛的大鼠模型,考察不同黃柏炮制品對于腎陰虛大鼠的治療效果,并通過實驗結果可以看出黃柏經過鹽炙之后有更好的滋腎陰、瀉腎火的作用［9］。本實驗將前期的藥效學進行機理上的驗證,即為黃柏經過鹽炙之后,可以增強其有效成分在腎組織的吸收。

本實驗通過給予大鼠不同炮制品的黃柏水煎液,考察其中生物堿類成分在腎組織臟器的藥物濃度情況,發現鹽炙品濃度高于生品,從腎組織吸收率的角度驗證了黃柏“鹽炙入腎” 的理論。而黃柏如何經過鹽炙后,使其生物堿類成分在腎組織吸收效率提高,還需要從黃柏有效成分與腎組織的靶標酶以及生物堿類成分與腎小管上皮細胞的透過率進一步深入研究。