山仙顆粒對大鼠肝癌前病變Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達水平的影響

潘艷芳，賈曉濤，芮 冉，應小平，方 艷，孟博博

（1.陜西中醫藥大學基礎醫學院，陜西咸陽 712046；2.西安市中心醫院神經內科，陜西西安 710006）

原發性肝癌是全球第四大導致癌癥死亡的主要原因。在過去幾年中,大多數國家的5年生存率不到20%［1-2］。在我國,由于乙肝病毒的高感染率而導致慢性肝病、肝硬化、肝癌的高發性［3-4］。肝炎-肝纖維化-肝癌前病變-肝癌是慢性肝病的惡性發展過程,在目前尚不能治愈肝癌的情況下,世界著名科學雜志提出“預防腫瘤的發生比治療腫瘤更重要”［5］。肝癌前疾病是指具有惡性轉變可能的肝臟良性病變,包括肝硬化、肝細胞的再生結節、腺瘤樣增生等［6］。若能及時阻斷其病理進程,則可有效預防肝癌發生?，F代研究發現,肝癌前疾病的發生發展及惡化與信號通路的改變、血管生成及機體免疫微環境的異常、端粒酶活性的表達等因素密切相關［7-8］。其中,Wnt/β-catenin信號通路的改變在肝組織惡性改變中的作用尤為重要。研究發現,該信號通路不僅能調節正常肝細胞的再生,且能通過活化肝星狀細胞、激發細胞外基質的形成、改變肝內膽管形態等促進肝癌前疾病的發生發展［9-11］。因此課題組設想,是否可以通過下調Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白以抑制或逆轉其惡變。山仙顆粒是陜西中醫藥大學附屬醫院中西醫結合腫瘤內科團隊研發的抗腫瘤中成藥,其良好的療效使其廣泛應用于陜西中醫藥大學附屬醫院肝臟及肺臟等腫瘤的治療［12-13］。前期研究的結果,明確了山仙顆粒治療肝癌的機理［14］。本研究擬通過制造肝癌前疾病動物模型,采用HE染色、Masson染色、實時定量PCR、Western blot等實驗方法,觀察山仙顆粒是否通過影響Wnt/β-catenin信號通路來抑制或逆轉肝癌前疾病的發生發展。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取SPF雄性SD大鼠90只,體質量（190±10）g,由西安交通大學實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號SCXK （川）2015-030。

1.2 藥物、試劑與儀器 山仙顆粒由西洋參、鱉甲、龜板、莪術、生山楂、仙鶴草、丹參、薏苡仁、豬苓組成,是陜西中醫藥大學附屬醫院院內制劑 （生產批號20180204）,由陜西中醫藥大學藥劑科制備,水提過濾、減壓濃縮干燥,干膏得率約為25.2%,成品顆粒的臨界相對濕度為62%,休止角為29.89,規格10 g/包。分別配置比例為山仙顆粒（g）∶生理鹽水（mL）為1 ∶40,配成0.1、0.05、0.025 g/mL的高、中、低劑量混懸液,制備后貯存于4 ℃冰箱中備用。根據人、動物體質量計量換算法計算,大劑量組（2 g/kg）、中劑量組（1 g/kg）、小劑量組（0.5 g/kg）分別相當于臨床等效劑量的4、2、1倍。二乙基亞硝胺購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司（生產批號20180309,規格為25 mL/瓶）。KYA1797K（S8327,美國Selleck公司）；Anti-Wnt3a抗體（ab219412,英國Abcam公司）；Anti-β-catenin抗體（ab6302,英國Abcam公司）；Anti-c-Myc抗體 （ab32072,英國Abcam公司）；Anti-GAPDH抗體 （ab9485,英國Abcam公司）；RNA iso Plus試劑盒（D9108B,日本Takara公司）；反轉錄試劑盒（D6130,日本Takara公司）；羅氏Green PCR Master Mix （QPK-201,日本Toyobo公司）；HE染色試劑盒（G1120,北京索萊寶科技有限公司）；Masson染色試劑盒（G1340,北京索萊寶科技有限公司）；RM2235石蠟切片機（德國徠卡公司）；7500實時PCR系統（美國Applied Biosystems公司）；蛋白電泳系統（美國Bio-Rad公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 動物分組、造模及干預 80只SD大鼠隨機分為空白組,模型組,山仙顆粒大、中、小劑量組和Wnt/βcatenin抑制劑KYA1797K （陽性對照組）。大鼠肝癌前病變模型制備［15-16］：大鼠適應性飼養1周后進入實驗,將配制好的二乙基亞硝胺分別腹腔注射（50 mg/kg,2次/周）于模型組,山仙顆粒大、中、小劑量組,Wnt/β-catenin抑制劑組大鼠,空白組大鼠腹腔注射生理鹽水,至16周結束。山仙顆粒大、中、小劑量組大鼠分別以中藥灌胃（2、1、0.5 g/kg）,每日1次；Wnt/β-catenin抑制劑組大鼠腹腔注射KYA1 797 K （25 mg/kg）,每日1次；同時,空白組、模型組給予等劑量生理鹽水灌胃,連續給藥16周結束。

1.3.2 取材及指標測量 16周最后一次造模和用藥后禁食24 h,大鼠稱定質量,并用 10% 的水合氯醛（0.35 mL/kg,腹腔注射）麻醉,75%的酒精消毒腹部皮膚并放于超凈工作臺,開腹,下腔靜脈取血送于陜西中醫藥大學附屬醫院生化科檢測肝功能相關指標谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、谷氨酰轉肽酶（GGT）的變化。ALT、AST和GGT是診斷肝臟疾病的重要指標。隨著肝細胞損傷情況越嚴重,其血清ALT、AST和GGT水平上升程度越高。腹腔內取出肝臟,稱定質量、觀察肝臟顏色、質地、表面是否有結節及結節數目,若有結節,取結節及其周圍肝臟約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 2塊,如果沒有結節和病變,肝臟隨機取約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 1塊放入10% 的福爾馬林中固定,石蠟包埋備,用另一塊放于-80 ℃備用,其余肝臟組織放于-80 ℃保存。

1.3.3 HE染色 取各組的肝組織進行固定、脫水、浸蠟與包埋,以3 μm厚度進行切片；60 ℃烤片1 h后常規脫蠟至水。取出玻片,蘇木素浸泡5～20 min進行染色,用自來水沖洗1 min,鹽酸乙醇分化液分化15 s,自來水沖洗15 min,伊紅染色2 min,自來水浸泡5 min。然后進行脫水與透明,中性樹膠進行封片。晾干后顯微鏡觀察。

1.3.4 Masson染色 取各組的肝組織切片脫蠟至水,用配制好的Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min。用1%鹽酸乙醇分化液分化5～15 s、水洗,Masson藍化液返藍3～5 min、水洗、蒸餾水洗1 min。麗春紅品紅染色液染色。磷鉬酸溶液洗1～2 min,弱酸工作液洗1 min。直接放入苯胺藍染色液中染色1～2 min,弱酸工作液洗1 min。常規脫水透明中性樹膠進行封片；晾干后顯微鏡觀察。然后用計算機圖像分析系統對Masson染色的病理組織進行測量。測量內容：觀察每×100視野下假小葉數目、纖維間隔數目和纖維間隔的平均厚度（μm）。

1.3.5 實時熒光定量PCR取出肝組織后進行RNA提取。按Trizol法提取總RNA,核酸紫外分光光度計測定經稀釋的RNA提取物的OD值和含有量,判斷RNA純度,計算RNA含有量。經反轉錄試劑盒和羅氏Green PCR Master Mix進行反轉錄合成cDNA,設計合成針對不同目的片段的引物,以cDNA為模板進行Real Time PCR擴增。引物序列如下,Gapdh正向為5’ -AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’,Gapdh反向為5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’； Wnt-3a正向為5’ -TGCTGGACAAAGCTACCAGG-3’,Wnt-3a反向為5’ -CGAGACACCATCCCACCAAA-3’； β-catenin正向為5’ -CTGAGGACAAGCCACAGGA-3’,β-catenin反向為5’ -CACCAATGTCCAGTCCGAGA-3’； c-Myc正向為5’ -CCACCTCCAGCTTGTACCTG-3’,c-Myc反向為5’ -GGAGGACTCAGCAGAGGAGA-3’。

1.3.6 Western blot取出凍存的肝組織,將組織加蛋白裂解液進行勻漿裂解,收集蛋白,Bradford法定量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液,98 ℃煮10 min,4 ℃放置。制備12% SDS-PAGE （十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺）分離膠和5%濃縮膠,蛋白上樣后用SDS-PAGE電泳分離蛋白,電轉移至尼龍膜,然后用5%脫脂牛奶封閉0.5 h,加入一抗4℃孵育過夜。TBST （緩沖液）沖洗5 min,反復3次,加入二抗常溫搖床1 h孵育,TBST沖洗5 min,反復3次,滴加化學發光劑ECL進行發光顯影?；叶葤呙韬笥肐mageJ軟件分析條帶的灰度值,結果以各目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值的比值表示。

1.3.7 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料以（）表示,多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。 P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST、GGT水平比較 肝癌前病變發生發展過程中,肝細胞逐漸受到損傷,肝功能逐漸下降,因此在本實驗結束時,課題組采集了各組動物的靜脈血,測定反映肝功能相關指標ALT、AST、GGT的變化。如表1所示,與空白組比較,模型組ALT、AST、GGT水平均明顯高于空白組（P＜0.01）；與模型組比較,山仙顆粒小劑量組ALT、GGT均有所降低,但差異無統計學意義（P＞0.05）。而山仙顆粒大、中劑量組ALT、AST、GGT均降低明顯,差異具有統計學意義（P＜0.01,P＜0.05）。與模型組比較,Wnt/β-catenin抑制劑KYA1797K組ALT、AST、GGT均降低明顯,差異具有統計學意義（P＜0.01）。這些結果表明山仙顆粒大、中劑量能夠明顯減低二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠肝功能的下降。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、GGT水平（，n=15）

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、GGT水平（，n=15）

注：與空白組比較,**P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

2.2 肝臟總體外觀 如圖1所示,空白組大鼠肝臟顏色鮮紅,表面光滑且無結節；模型組大鼠肝臟顏色暗紅,表面不光滑且有大量大小不等的結節；山仙顆粒小劑量組大鼠肝臟顏色暗紅,表面凹凸不平,可見較多大小不等的結節。山仙顆粒中劑量組大鼠肝臟顏色較暗紅,表面可見大小不等的結節,其結節數少于模型組和山仙顆粒小劑量組；山仙顆粒大劑量組肝臟顏色稍暗紅,表面不光滑,有顆粒感,可見若干小結節。Wnt/β-catenin抑制劑KYA1797K組肝臟顏色變暗,表面不光滑,可見少量小結節,其結節數明顯比模型組減少。這些結果表明大、中劑量山仙顆粒能夠明顯緩解二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠肝臟的病變程度。

圖1 各組大鼠肝臟的總體外觀

2.3 HE染色結果 為了進一步觀察肝臟微細結構的變化,將各組大鼠的肝組織做成石蠟切片進行HE染色,如圖2所示,光鏡下觀察,空白組大鼠的肝細胞形態正常,沿中央靜脈呈放射狀排列,無明顯的水腫、脂變、壞死和纖維增生；模型組大鼠肝細胞排列紊亂,可見水腫、脂變,肝組織內有大量假小葉形成；山仙顆粒小劑量組大鼠肝細胞排列紊亂,可見大量肝細胞水腫、脂變、壞死,肝組織內有假小葉生成,但較模型組少；山仙顆粒中劑量組大鼠肝細胞排列紊亂較模型組輕,肝組織中未見明顯假小葉,可見大量纖維增生、水腫、脂變、壞死,但較模型組和山仙顆粒小劑量組減輕；山仙顆粒大劑量組大鼠肝細胞排列基本正常,肝臟內有少量纖維增生、細胞水腫、脂變、壞死,其程度比中劑量山仙顆粒減輕。KYA1797K組大鼠肝細胞排列基本正常,肝臟內有少量纖維增生、細胞水腫、脂變、壞死,其程度比模型組和山仙顆粒小、中劑量組減輕。這些結果表明山仙顆粒大、中劑量能夠明顯改善二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠肝臟的病理損傷程度。

圖2 各組大鼠肝臟組織HE染色（×200）

2.4 Masson染色結果 如圖3所示,空白組大鼠肝細胞索排列整齊,肝小葉結構完整清晰。模型組大鼠肝組織中纖維增生明顯,藍色纖維明顯增多、增粗,匯管區顯著增寬,廣泛假小葉形成,形成纖維間隔破壞界板,分割包繞肝小葉。與模型組比較,KYA1797K組和山仙顆粒中、高劑量組假小葉數目均明顯減少,纖維間隔的數目和厚度也明顯減少（P＜0.05、 P＜0.01）,見表2。這些結果表明山仙顆粒大、中劑量能夠減少二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠肝臟的纖維化程度。

圖3 各組大鼠肝臟組織Masson染色（×100）

2.5 大鼠肝組織中Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達水平 從慢性肝炎發展到肝細胞癌的過程中,Wnt/βcatenin信號通路被持續激活,為了檢測山仙顆粒對二乙基亞硝胺引起的肝臟損傷發揮保護作用的機制研究,本研究檢測了各組大鼠肝組織中Wnt/β-catenin信號通路關鍵分于Wnt-3a、 β-catenin和c-Myc的表達。如圖4所示,與正常組比較,模型組Wnt-3a、 β-catenin和C-MycmRNA的表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較,山仙顆粒小劑量組Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達無顯著差異（P＞0.05）,山仙顆粒中劑量組Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達明顯降低（P＜0.05）。山仙顆粒大劑量組Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達下降的更顯著（P＜0.01）。KYA1797K組Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達也顯著降低（P＜0.01）。這些結果表明山仙顆粒能夠劑量依賴性減少二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA的表達。

表2 各組大鼠肝組織的假小葉和纖維間隔數目（，n=15）

表2 各組大鼠肝組織的假小葉和纖維間隔數目（，n=15）

注：與空白組比較,** P＜0.01；與模型組比較,# P＜0.05,##P＜0.01。

圖4 實時定量PCR檢測各種動物肝組織中Wnt-3a、 β-catenin、 c-MycmRNA水平

2.6 大鼠肝組織中Wnt-3a、β-catenin和c-Myc蛋白的表達水平 Western blot檢測及圖像分析結果顯示（圖5）,與空白組比較,模型組Wnt-3a、β-catenin、c-Myc蛋白表達量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較,山仙顆粒大、中劑量組Wnt-3a、β-catenin、c-Myc蛋白表達量降低,差異明顯（P＜0.01,P＜0.05）,而山仙顆粒小劑量組Wnt-3a、β-catenin、c-Myc蛋白表達量差異均不明顯（P＞0.05）。與模型組比較,KYA1797K組Wnt-3a、β-catenin和c-Myc蛋白的表達也顯著降低（P＜0.01）。這些結果表明山仙顆粒能夠劑量依賴性抑制二乙基亞硝胺所致的肝癌前病變模型大鼠Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白Wnt-3a、β-catenin和c-Myc表達水平。

3 討論

癌前病變是指某些具有癌變潛在可能性的良性病變或疾病,若長期不能治愈即有可能轉變為癌。如果能早期發現和及時治愈癌前病變和疾病,對腫瘤的預防具有重要意義。本研究采用腹腔注射二乙基亞硝胺成功誘導了具有肝硬化背景的肝癌前病變模型,并觀察了山仙顆粒對肝癌前病變的影響,結果發現山仙顆粒中、大劑量能夠明顯改善肝癌前病變大鼠的肝功能和緩解其肝臟病變損傷程度。

癌前疾病的發生發展及惡化與信號通路的改變密切相關。Wnt/β-catenin信號通路在肝臟再生和肝癌的發生發展過程中都具有重要的作用,本研究首次觀察了山仙顆粒對肝癌前病變大鼠Wnt/β-catenin信號通路的影響,探討其治療肝癌前病變的作用機制。Wnt-3a為該信號通路的重要蛋白,研究證實在Wnt配體的刺激下,Wnt-3a與跨膜卷曲蛋白受體（FZD）等結合,從而影響糖原合成激酶3的活性,抑制β-catenin的降解,使其在細胞質中大量聚集,βcatenin聚集量增加到一定程度時其可進入細胞核內,從而激活該通路下游靶基因c-Myc、cyclinD1等,促進肝癌的發生發展［17］。據報道,肝硬化患者肝臟中β-catenin明顯增高,而通過各種方法抑制β-catenin的表達可有效改善肝硬化的進展［18］。研究發現,β-catenin在細胞質和細胞核的聚積是Wnt/β-catenin信號通路活化的核心事件,且在肝臟非纖維化組織中β-catenin的表達呈弱陽性,在肝硬化組織中其陽性表達增加,而在肝癌組織中其呈中等強度表達,使用其通路抑制劑后該蛋白的表達明顯減弱［19］。本研究中給大鼠腹腔注射KYA1797K,Wnt/β-catenin信號通路的一個高度選擇性抑制劑［20］,結果發現Wnt/β-catenin信號通路的抑制確實能夠減輕二乙基亞硝胺所致大鼠肝臟的損傷。

山仙顆粒包括西洋參、丹參、莪術、鱉甲、龜板、生山楂、仙鶴草、薏苡仁、豬苓、全方藥物配伍嚴謹,諸藥合用,共同達到活血化瘀、益氣養陰、扶正祛邪的功效。本實驗證明,山仙顆粒能夠明顯能夠改善肝癌前病變大鼠肝臟的纖維化程度,降低變性、壞死的肝細胞數目,減少異型增生結節的數目和體積。qPCR及Western blot結果顯示,模型組大鼠的Wnt-3a、 β-catenin和c-MycmRNA及蛋白表達量較空白組顯著升高（P＜0.01）,山仙顆粒對其具有顯著的下調作用（P＜0.05）。綜上所述,山仙顆粒能夠抑制肝細胞異常增生及肝硬化形成,有效抑制肝癌前病變的發生、發展,其作用機制與其調控Wnt/β-catenin信號通路密切相關。

圖5 Western blot檢測各組大鼠肝組織中Wnt-3a、β-catenin、c-Myc蛋白表達水平