七葉一枝花中6種甾體皂苷與土壤肥力的相關性探究

劉 哲，余孟杰，向海燕，威則日沙，任朝琴，楊正明，劉 圓

（1.西南民族大學藥學院，四川成都 610041；2.阿壩師范學院藥學院，四川阿壩州 623002；3.西南民族大學醫藥研究院，四川成都 610041）

七葉一枝花 （華重樓） Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara.的根莖為2015年版《中國藥典》重樓項下收錄品種之一［1］。甾體皂苷是重樓根莖主要活性成分,具有抗腫瘤、消炎、止血、抗菌、鎮痛、鎮靜、抗氧化、免疫調節、抑制血管生成、保護肝臟與腎臟等作用［2-3］。2005年以前,全國幾乎沒有重樓人工種植,重樓與土壤肥力的關系少有學者研究。近十多年來,重樓種植已成規模,種植面積不斷擴大,土壤營養狀況不均衡會導致重樓根莖品質下降［4］,探討七葉一枝花活性成分與其生長環境的關系可以為其種植提供參考。目前對于重樓活性成分與其生長環境的關系研究報道較少,主要以滇重樓為主,相關研究［5-9］結果顯示在一定范圍內,土壤營養與滇重樓皂苷含有量存在影響,對于七葉一枝花的報道幾乎沒有,土壤肥力是影響七葉一枝花皂苷含有量的重要因素,適宜的土壤條件是七葉一枝花高產優質的重要基礎。

因此,在前人研究［10-17］的基礎上以UPLC-ELSD為技術手段,采用外標法分析測定其皂苷含有量,擬用5個產地中6種皂苷含有量與相應土壤肥力指標含有量進行多元統計分析,探討七葉一枝花皂苷含有量與土壤因子之間的量化關系。因此,對實地采集的10批樣品進行質量分析與評價,以期揭示影響其皂苷積累的主導因子,為七葉一枝花的規范化栽培管理以及適宜生長區的確定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與藥物 Waters Acquity UPLC? 超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；METTLER AE240電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-5200E型超聲波清洗器（40 kHz、250 W,昆山超聲儀器有限公司）；ProElut C18反相硅膠鍵合固相萃取柱（北京迪科馬科技有限公司）。柴胡皂苷D （MUST-16060106）、纖細薯蕷皂苷 （MUST-15081110）、重樓皂苷Ⅰ（MUST-15061611）、重樓皂苷Ⅱ（MUST-15060810）、重樓皂苷Ⅵ（MUST-14071904）、重樓皂苷Ⅶ（MUST-14060302）均購于成都曼思特生物科技有限公司；偏諾皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基 （1 →3）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷、重樓皂苷H均由四川大學華西藥學院張浩教授課題組分離所得（純度≥98%）；甲醇（分析純,成都市科龍化工試劑廠）；乙腈（色譜純,美國Sigma公司）；蒸餾水［屈臣氏集團（香港）有限公司］。

1.2 材料 七葉一枝花樣品自采于四川省不同地區,五點法采樣,并收集根莖土壤,所有藥材樣品經四川大學華西藥學院張浩教授和西南民族大學劉圓教授鑒定為正品。藥材洗凈,干燥,粉碎過3號篩,備用；土壤樣品,撿出雜物后,風干,過20目篩,備用。信息見表1。

表1 樣品信息

1.3 方法

1.3.1 皂苷含有量測定

1.3.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC? HSS C18色譜柱（2.1 mm×75 mm,1.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（B）,梯度洗脫程序見表2；體積流量0.2 mL/min；柱溫40 ℃；分析時間22 min；進樣量2 μL；ELSD檢測器,增益500,冷卻模式；漂移管溫度55 ℃；氮氣壓力40 psi （1 psi=6.895 kPa）?；旌蠈φ掌穲D見圖1,樣品色譜圖見圖2。

表2 梯度洗脫程序

圖1 混合對照品中各成分UPLC色譜圖

1.3.1.2 溶液制備 對照品溶液、供試品溶液制備按照課題組已經建立的方法［17］。

圖2 七葉一枝花根莖外標法各成分UPLC色譜圖

1.3.2 方法學考察 按2015年版《中國藥典》 方法考察穩定性、重復性、精密度,RSD值均小于1.9%；6種皂苷加樣回收率分別為重樓皂苷Ⅶ96.43%,RSD為0.87%；偏諾皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→3）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷98.13%,RSD為0.54%；重樓皂苷H 97.68%,RSD為0.91%；重樓皂苷Ⅵ98.62%,RSD為0.78%；柴胡皂苷D 96.28%,RSD為1.28%；重樓皂苷Ⅱ96.45%,RSD為0.94%；纖細薯蕷皂苷98.36%,RSD為0.97%；重樓皂苷Ⅰ為95.67%,RSD為0.58%。

1.3.3 土壤肥力指標測定 土壤肥力指標測定參考《土壤農業化學分析方法》［18］,其中土壤有機質采用硫酸-重鉻酸鉀法,堿解氮采用堿解擴散法,速效磷采用鉬銻抗比色法,速效鉀采用乙酸銨提取-火焰光度法。

2 結果與分析

2.1 主要數值測定結果 將采集的10個生長地區的七葉一枝花根莖中6種甾體皂苷含有量測定結果（S1～S10）和構建的理想含有量（參考藥材）（S0）的8個考察性狀的最大值見表3,土壤肥力指標測定結果見表4。

2.2 灰色關聯度分析法分析

2.2.1 建立矩陣 利用Excel軟件,采用均值計算方法,公式

其中i=0,1,2,…,m； k=0,1,2,…,n,建立矩陣并進行無量綱化處理。設待評的七葉一枝花為m,評價指標為n；通過比較數列值與相對應的參考數列值的差的絕對值計算差序列值。

2.2.2 關聯系數計算 各指標與理想值的吻合程度呈正相關,關聯系數越大,表明某指標越接近理想值。計算各參評材料與理想材料的關聯系數,結果見表5。

2.2.3 歸一化處理與灰色關聯指標 由表5可知,關聯系數多,不易比較,因此有必要將各個時刻的關聯系數集中為一個值,而求關聯度平均值便是這種信息集中處理的一個方法?？汕蟮酶髦笜说年P聯度（ri）,再將其歸一化處理可得各個指標的權重,結果見表6；灰色關聯評價指標公式：,其中ωκ 為權重系數,將表5～6所得結果代入并計算,求出各指標的灰色關聯評價指標,并對所得值大小進行排序,結果見表7?；疑P聯度分析結果關聯度排序為S3＞S10＞S9＞S5＞S7＞S6＞S4＞S2＞S1＞S8,關聯度差異較大,最大差異達到了97.18%,能夠很好的區分材料的質量優劣；其中品質排名前六名的七葉一枝花材料編號為S10、S3、S9、S5、S7、S6,并且均符合《中國藥典》 規定要求。即影響七葉一枝花質量優劣的因素主要為其中6種皂苷的含有量。

表3 10批樣品根莖中6種甾體皂苷含有量（%）

表4 土壤肥力測定

表5 關聯系數

表6 指標歸一化處理（權重系數分配）

2.3 不同樣地土壤肥力與不同皂苷含有量分布特征 對10批樣品中的6種皂苷數據,與其所對應的土壤肥力指標繪制折線圖,分析其單一土壤肥力對重樓皂苷的影響,結果見圖3。

圖3表明,在pH 5左右、有機質含有量在33 g/kg、堿解氮含有量在175～180 mg/kg、速效磷含有量在50 mg/kg左右時重樓皂苷含有量最大,隨著pH、有機質、堿解氮、速效磷含有量增大或減小皂苷含有量呈逐漸降低趨勢；速效鉀含有量在160 mg/kg左右時重樓皂苷含有量最大,隨著速效鉀含有量增大皂苷含有量呈逐漸降低趨勢。因此采用相關性分析法,進一步驗證重樓皂苷與土壤肥力的相關性。

圖3 重樓皂苷含有量與土壤肥力關系

表7 灰色關聯度法結果分析

2.4 皂苷含有量與土壤肥力的相關性分析 利用SPSS 21.0軟件對10批樣品中的6種皂苷數據,與10批樣品所對應的土壤肥力指標進行相關性分析,結果見表8。

由表9顯示,重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ與速效鉀在0.05水平上呈顯著負相關；重樓皂苷Ⅱ、纖細薯蕷皂苷與速效磷在0.01水平上呈顯著正相關。表明,七葉一枝花中皂苷含有量與土壤元素中的速效磷、速效鉀的含有量有直接作用,與pH、有機質、堿解氮無直接影響。其中重樓皂苷Ⅶ、Ⅰ沒有體現出與土壤元素的關系,分析其原因可能是數據數量不足,有待進一步研究考證。采用逐步回歸分析法,可解釋以上變量與6種皂苷含有量之間的線性關系。

表8 6種甾體皂苷含有量與土壤肥力肥力指標相關性分析

2.5 逐步回歸分析 根據皂苷含有量與土壤肥力指標的相關性分析結果,分別以七葉一枝花根莖中的重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、纖細薯蕷皂苷4種皂苷作因變量（Y）,以5個土壤主要化學性狀pH （X1）、有機質（X2）、堿解氮（X3）、速效磷（X4）、速效鉀（X5）作自變量,應用多變量逐步回歸剔除對七葉一枝花活性成分含有量影響較小的因子,建立七葉一枝花活性成分含有量與主導因子的回歸方程,見表9。

表9 土壤肥力指標與6種甾體皂苷含有量的逐步回歸分析

結合回歸方程可得,影響重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ含有量的主導因子為土壤有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀；影響重樓皂苷Ⅱ含有量的主導因子為速效磷；影響纖細薯蕷皂苷含有量的主導因子為速效磷；影響重樓皂苷Ⅵ、Ⅰ、Ⅶ、Ⅱ總和的含有量的主導因子為速效鉀；影響重樓6種皂苷總和含有量的主導因子為有機質、速效磷、速效鉀。重樓皂苷Ⅱ及纖細薯蕷皂苷主導因子數目較少、決定系數r較小,影響不同成分的主導因子有所不同。

3 討論

在課題組實際研究中發現七葉一枝花中含有的6種皂苷,與文獻［19-22］相符；但偏諾皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→3）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷含有量極低,與文獻［23］結果有差異,分析其原因可能與華重樓生長過程中不同生態因子有關；本研究發現多數七葉一枝花含有量要求達不到《中國藥典》 規定標準0.6%；七葉一枝花質量長期不合格,重樓皂苷Ⅵ、Ⅱ、Ⅰ含有量很少甚至沒有,這與《中國藥典》 質量標準完全沖突,因此建議新版《中國藥典》 修訂七葉一枝花的質量標準。重樓皂苷H在所有樣品中均檢測到了,其作為七葉一枝花主要皂苷成分之一,且文獻［24］表明重樓皂苷H功效為誘導血小板凝結聚集,具有止血作用,因此,建議將重樓皂苷H作為新版《中國藥典》 重樓項下的七葉一枝花的質量評價標準之一。

檢測的10批根莖樣品,重樓皂苷Ⅶ在所有樣品中均檢測到,僅在樣品S9、S10中檢測到重樓皂苷Ⅵ,而在S9、S10樣地的土壤肥力中速效鉀的含有量最少,表明速效鉀是影響重樓皂苷Ⅵ的重要因素；僅在樣品S3中檢測到重樓皂苷Ⅱ、纖細薯蕷皂苷,而在S3樣地的土壤肥力中速效磷的含有量最高,表明速效磷是影響重樓皂苷Ⅱ、纖細薯蕷皂苷的重要因素。

目前灰色關聯度方法已廣泛應用于番茄［25］、小麥［26］、柴胡［27］、秦艽［28］、甘松［29］、黃芪［25］等質量評價方面,并且在作物與土壤施肥的相關性［26］中也有應用；逐步回歸分析法也良好的運用在中藥材何首烏質量評價體系中［30］。本研究聯合應用灰色關聯度法、相關性分析法以及回歸分析法等多維統計分析對采自不同四川產地的人工栽培七葉一枝花藥材質量進行綜合評價分析,從綜合質量評價角度提供可參考的研究模式。