Cullin7 泛素連接酶在生長控制和腫瘤發生發展的作用

牟宇，陳治軍，謝騰，向旭

(湖北民族大學荊門臨床醫學院，湖北 荊門)

1 CRL7Fbxw8 復合體的結構和功能

CRL7Fbxw8 復合物是cullining E3 泛素連接酶(CRL)家族的成員[1]。CRL7Fbxw8 包括cullin 7，WD40 重復序列，包含F-box 蛋白Fbxw8，適配器蛋白Skp1，以及環finger 蛋白ROC1[2]。

CRL7Fbxw8 具有兩個獨特的生化特性。首先，CUL7 是一種非典型的cullin 家族蛋白。CUL7 的主要功能是提供組織E3 CRL 復合物的分子支架。然而，人類CUL7 包含1698個氨基酸，其大小是規范的cullin 分子的兩倍多。如下所述，CUL7 似乎包含多個蛋白質-蛋白質相互作用域，從而為蛋白水解和非蛋白水解活性提供了一系列生化功能。其次，雖然CUL7 組裝了SCF/CRL1 類復合物，但它主要通過與Skp1-Fbxw8 相互作用而顯示出顯著的選擇性。自從對CRL7Fbxw8復合物的首次報道以來[2]，許多獨立的報告證實了CUL7-Fbxw8 的關聯[3-8]。但是當前沒有高分辨率CUL7-Fbxw8 相互作用的結構模型，以幫助理解選擇性的分子基礎。

3-M 是一種人類常染色體隱性生長遲緩綜合征[9]。2005年，首次將cul7 生殖系突變與3-M 綜合征聯系起來[10]。自那時起，就證實并擴展了這種聯系[11-12]。迄今為止，已有64個3-M 連鎖的cul7 突變被報道。這些突變跨越了整個CUL7編碼序列。許多突變可能通過mRNA 衰變或顯著的蛋白質截短機制而使CUL7 活性喪失。然而，還是存在可以幫助CUL7結構活性關系分析的取代突變。例如，源自3-M 的錯義突變H1464P 駐留在CUL7cullin 結構域中，并且被證明引起E3 連接酶活性的降低[10]。此外，CUL7 突變可能與3-M 矮小綜合征有關。

隨后的研究發現，obscurin-like 1(OBSL1)[13]和包含8 的卷曲螺旋結構域(CCDC8)[14]的突變也會導致3-M 綜合征。CUL7 似乎是導致3-M 綜合征的主要基因。3-M 突變的發生率在CUL7 中約為70%。在OBSL1 中為20%，而在CCDC8中為10%以下[15]。

CUL7，OBSL1 和CCDC8 似乎也相關聯。證據表明，CUL7，OBSL1 和CCDC8 在指定為3-M 的復合體中，其中還包括Fbxw8[8]。OBSL1 是一種細胞骨架銜接蛋白，將細胞的內部細胞骨架連接到細胞膜。CCDC8 包含多個蛋白質-蛋白質相互作用域，能夠與OBSL1、CRL7Fbxw8 相互作用，以及通過其C 末端定位的PxLPxL 基序相互作用的其他蛋白質[16]。

在最近的一項研究中表明CCDC8 僅位于質膜上。CK2和GSK3 將CCDC8 磷酸化，使其與OBSL1 和CUL7 結合，從而導致膜相關的3-M 復合物組裝。這些作者進一步確定了質膜蛋白LL5β 是3-M 復合物的底物[17]。Wnt 信號轉導抑制CCDC8 磷酸化會破壞3-M 復合物的膜定位和LL5β 的積累。在表達帶有3 個衍生突變的CUL7 或OBSL1 的細胞中也觀察到了此類缺陷。小鼠中Ccdc8 的缺失導致滋養細胞遷移和胎盤發育缺陷，并表現出子宮內生長受限和圍產期致死性。

2 CRL7Fbxw8 在生長控制中的作用

cul7 突變與人類遺傳綜合征3-M 和雅庫特綜合征的關聯，證明了CRL7Fbxw8 在生長控制中的作用[10]。與人類遺傳學證據一致，小鼠cul7 基因的定向破壞導致嚴重的子宮內發育遲緩(IUGR)，在妊娠后期和胎盤異常時胎兒明顯較小[2]。CUL7 基因在IUGR 中被上調多達10 倍，在與IUGR 相關的子癇前期中被上調15 倍[18]。生長激素信號轉導的失調似乎是3-M 綜合征的特征。例如，攜帶cul7 或ccdc8 突變的3-M患者的成纖維細胞分別顯示IGF1 或生長激素信號轉導受損。包含obsl1 突變的3-M 成纖維細胞在兩種途徑中均表現出損傷[15]。

fbxw8 基因的破壞導致表型較輕，異常主要局限于胎盤和生長[19]。大約30%的純合子fbxw8-/-后代成年，即使在整個產后發育期間它們的體型都小于野生型同窩仔。因此，CUL7 和Fbxw8 在生長控制中具有重疊的功能，這與CUL7 使用Fbxw8 介導增殖活性的假設相一致。另一方面，cul7 -/-小鼠的更嚴重的表型暗示Fbxw8 獨立功能。

有人提出了一些蛋白質水解機制解釋CRL7Fbxw8 在生長中的作用，控制總結如下。

IRS1 和mTORC1 負反饋回路：胰島素或胰島素樣生長因子(IGF)通過與受體結合來刺激生長。配體結合受體酪氨酸激酶然后在多個酪氨酸殘基處磷酸化胰島素受體底物(IRS1)。由此產生的磷酸酪氨酸提供了能夠招募含有SH2(Src 同源2)的信號蛋白的對接位點，這些信號蛋白包括PI3-K(磷酸肌醇3-激酶)和Grb2(生長因子受體結合蛋白2)，從而分別激活下游Akt(蛋白激酶B；通過PI3-K)和RAS(通過Grb2)途徑?；罨腁kt 抑制TSC1/2(結節性硬化1/2)復合物，從而釋放小G 蛋白Rheb(Ras 同系物enrichedinbrain)。mTORC1(雷帕霉素復合物1 的蛋白激酶機制靶點)[20-21]和下游效應酶6K1(s6kinase1)，導致核糖體生物生成和細胞生長[22-23]。高活性mTORC1/S6K1 催化多位點IRS1 seryl 磷酸化，抑制IRS1與胰島素/IGF-1 受體相互作用的能力，并促進蛋白酶體降解[24]。這種mTORC1/IRS1 負反饋減弱PI3-K 活性的強度或持續時間，以確保最佳的mTORC1 信號[23]。

幾項證據表明CRL7Fbxw8 在mTORC1/IRS1 負反饋控制中的作用是通過靶向IRS1 實現泛素非依賴性降解。Fbxw8與IRS1 結合并促進其泛素化和蛋白酶體降解；Fbxw8 和CUL7 的失活/ 缺失分別累積IRS1。重要的是，fbxw8 誘導的IRS1 降解依賴于mTORC1 活性[25]。為了支持這些觀察，發現cul7 -/-小鼠的胚胎成纖維細胞積累了IRS1，并表現出IRS1 下游途徑Akt 和MEK/ERK 的激活增加。有學者提出，過度激活的mTORC1/S6K1 引發IRS1 的多位絲氨酸磷酸化，觸發IRS1 與CRL7Fbxw8 的結合，導致IRS1 泛素化和降解，進而導致PI3-K/Akt 活性減弱。

大量的生化[26]和生理學[27]證據證實，IRS1 降解信號序列被映射到其N 端574 個氨基酸殘基上。在該片段中，Ser-307/Ser-312 和Ser-527 構成S6K1 磷酸化共有位點，這些位點被認為是支持Crl7FBxW8 介導降解所必需的[26]。利用體外重建系統，用S6K1 刺激CRL7Fbxw8 對IRS1 N 末端片段的泛素化作用，但作用水平較低。相反，CRL7Fbxw8 支持從感染昆蟲細胞中分離的高磷酸化IRS1 N 末端片段的高效泛素化。這些數據表明激酶需要額外的磷酸化還沒有確定。有人提出，IRS1 的N 末端需要多磷酸化才能確保只有當mTORC1和S6K1 達到極高水平時，IRS1 才會完全降解。此外，在cul7小鼠胚胎成纖維細胞中觀察到胰島素刺激增強的AKT 和MAP 激酶磷酸化[27]。與此一致，C2C12 肌管中的RNA 干擾導致CUL7 基因敲除，從而導致胰島素消化途徑和細胞葡萄糖攝取水平升高。CUL7 的缺失降低了這些細胞介導胰島素誘導的irs1 降解的能力。在小鼠模型中，與野生型對照組相比，雜合子CUL7 或fbxw8 在胰島素刺激下提高了骨骼肌組織中PI3-K/AKT 的激活。最后，在cul7 + /或fbxw8 + /小鼠中觀察到增強了胰島素敏感性和血漿葡萄糖清除率另一項研究表明，通過直接磷酸化Fbxw8，IRS1 的mTORC2 依賴性反饋抑制作用，導致該F-box 蛋白的穩定性增強，從而促進IRS1降解[28]?？傊?，這些研究表明CRL7Fbxw8 在影響mTORC1和mTORC2 信號傳導中起著重要作用。然而，有些研究與上述觀點不一致，他們認為盡管未檢查IRS1 的磷酸化狀態，但未能觀察到CRS7 耗盡的細胞中IRS1 的積累[29]。最近，已確定人類IRS1 S422 是mTORC1 磷酸化的關鍵殘基，其似乎觸發了與SCF/CRL1βTrCP 的相互作用以進行降解[30]。然而，需要進一步的工作來為βTrCP 與IRS1 S422 degron 肽的直接結合提供證據，這與充分定義的βTrCP 底物結合共有基序顯著不同。

TBC1D3 和生長因子信號轉導：人源特異性TBC1D3 腫瘤蛋白增強生長因子受體信號傳導，隨后促進細胞增殖和存活。TBC1D3 響應于生長因子信號而降解，從而構成生長因子驅動的負反饋回路[5]。多種證據表明，CRL7Fbxw8 靶向TBC1D3，在血清和生長因子刺激下泛素化和降解。

Hippo 信號轉導與心肌細胞增殖：利用心肌細胞模型，發現心肌細胞增殖抑制，可能與Hippo 激酶Mst1 和Lats1/2 的積累有關，提示Hippo-YAP 信號轉導在心臟發育中的作用。CUL7 參與控制Mst1 的豐度，因此參與Hippo-Yap 信號傳導和心肌細胞增殖[31]。

3 CRL7Fbxw8 在癌癥中的作用

P53: 已有研究報告了映射到CUL7 CPH 域和p53 的四聚化域的CUL7-p53 相互作用[32]。根據現有證據顯示，CUL7-p53 相互作用的結果似乎拮抗p53 的腫瘤抑制活性。細胞培養研究表明，CUL7 表達導致p53 轉錄活性降低[32]。細胞增殖速率的增加需要完整的p53[32]和抑制p53 對DNA損傷的激活[33]。其他證據包括CUL7 在抑制Myc 誘導的凋亡中的作用，盡管這種作用是否依賴于CUL7-p53 的相互作用還沒有被闡明[34]。到目前為止，還沒有證據表明crl7fbxw8通過泛素調節p53 而導致p53 穩定性的改變[33]。

SV40 T 抗原及其轉化：CUL7 最初通過免疫沉淀研究證明為宿主細胞蛋白p185[35]或p193[36]，其在1990 年代初與猿猴病毒40 大T 抗原相關，很久以后才被識別為成分E3 泛素連接酶復合物的合成[2]?，F有研究已將CUL7 結合位點定位于T 抗原69-83 位氨基酸[37]。與CUL7 結合缺陷的T 抗原突變體，雖然仍能與p53 和pRb 相互作用，但不能誘導小鼠胚胎成纖維細胞增殖。這些數據表明T 抗原的轉化能力不僅需要p53 和pRB，還需要CUL7 活性的失活。這些結果證明了CUL7 作為腫瘤抑制因子的作用，至少需要存在有效的腫瘤蛋白T 抗原的情況下。

為了驗證上述觀點，已有研究表明，野生型T 抗原，抑制了26S 蛋白酶體對CRL7Fbxw8 底物IRS1 的降解。在表達T抗原的細胞中觀察到IRS1 的積累和延長的半衰期。與此一致，純化的T 抗原抑制了CRL7Fbxw8 依賴的IRS1 泛素化[38]。此外，表達T 抗原的細胞，或通過RNA 干擾耗盡CUL7，顯示IRS1 下游信號通路PI3-K/AKT 和Erk 絲裂原激活通路激酶的激活增強，以及下游靶基因c-fos 的上調。最后，在T 抗原陽性的癌胚抗原424/SV40 LT 轉基因小鼠中檢測到IRS1 蛋白水平的升高和下游信號的激活?？傊?，這些結果提示T 抗原在保護IRS1 不被crl7fbxw8 降解中的作用。這種病毒活性可能在維持高水平的有絲分裂前IRS1 下游信號通路中發揮作用。

總體而言，這些研究可以調和CUL7 癌基因/腫瘤抑制因子悖論[39]。在正常細胞中，mTORC1/IRS1 反饋功能可確保正確的mTOR 信號傳遞[23]。CUL7 的缺失導致持續的mTOR 信號傳導，導致衰老[25]。這與CRL7Fbxw8 生長控制的作用保持一致。但是潛在的腫瘤蛋白T 抗原控制著細胞的高水平增殖。通過T 抗原介導的IRS1 降解抑制，打破mTORC1/IRS1 負反饋環，可能是維持有絲分裂前信號傳導，從而滿足增殖需要的必要條件。

細胞周期蛋白D1 與細胞周期：細胞周期進入S 期需要通過重新定位和降解去除cyclind1。持續的MAPK 信號傳導(腫瘤細胞特有的特征)導致細胞周期蛋白D1 在T286 磷酸化，從而觸發與CRL7Fbxw8 的相互作用，導致泛素依賴性蛋白酶體降解[7]。Fbxw8 基因敲除導致細胞周期蛋白D1 的大量積累，以及CDK1 的胞質隔離，導致細胞增殖的嚴重減少。細胞周期蛋白D1-T286A 的組成性核表達逆轉了這些效應。這些發現支持CRL7Fbxw8 通過細胞周期蛋白D1 的蛋白水解在癌細胞增殖中的作用。然而，來自fbxw8 小鼠或野生型的小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)顯示出相似的細胞周期蛋白D1 降解率。這些遺傳分析對Fbxw8 在正常細胞周期進程中細胞周期蛋白D1 降解中的重要作用提出了疑問[40]。

HPK1、MAPK 與胰腺癌：造血祖細胞激酶1(HPK1) 抑制MEK1/2 介導的ERK 活化，并通過蛋白酶體介導的降解在＞95%的胰腺癌中丟失。HPK1 可能是一種新型的腫瘤抑制因子，而HPK1 的缺失在胰腺癌的發展中起著至關重要的作用。敲除Fbxw8 可恢復內源性HPK1 蛋白表達并抑制胰腺癌細胞的細胞增殖。這些發現表明CRL7Fbxw8 在構成負反饋環以抑制HPK1 的生長抑制活性中起作用，并且CRL7Fbxw8促進胰腺癌細胞增殖。

4 結束語

自2002 年發現以來，CRL7Fbxw8 已被證實參與了十多種蛋白質底物的穩定性控制。另外發現了兩種3-M-連接蛋白OBSL1 和ccdc8 及其與CRL7Fbxw8 的聯系，突出了E3 復合物在其生物學功能和生長遲緩疾病中的重要亞細胞位置。

目前尚不清楚在小鼠cul7 基因敲除和/或帶有cul7 突變的人類3-M 綜合征中觀察到的生物學缺陷是否可歸因于發現的任何CRL7Fbxw8 底物的異常積累。迄今為止，可能我們還沒有鑒定出了CRL7Fbxw8 的某種底物，該底物起著主要的生長調節作用，并且在失調時會導致3-M 生長遲緩?；蛘?，3-M 可能是由受CRL7Fbxw8 影響的多種蛋白水解途徑失調引起的疾病。還應注意，CUL7 具有非蛋白水解功能，可能在細胞增殖和3-M 綜合征中起重要作用。

我們認為，繼續使用遺傳和生化方法將有助于更好地了解CRL7FBXW8 的生長控制和腫瘤中的作用，先進的小鼠模型可以用來模擬人類3-M 綜合征，更精確地闡明CRL7Fbxw8在細胞增殖信號通路中的作用。深入研究CRL7Fbxw8 的蛋白質和非蛋白質水解功能可能產生新的機制。希望這些發現能為3M 及相關生長遲緩綜合征的治療開辟新的治療途徑。