臍血單個核細胞移植對帕金森病的臨床療效研究

王未飛 于海燕 袁曉玲 趙敏 王敏 蘆倩 王甜 宮殿榮

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是僅次于阿爾茨海默病的全球第二大神經系統退行性變性疾病，其主要病理特征為腦內黑質多巴胺能神經元大量變性丟失，導致紋狀體多巴胺含量的缺乏，引起靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢步態異常和自主神經功能紊亂等一系列臨床表現。目前，PD 的發病機制尚不十分明確，線粒體功能紊亂、氧化應激和免疫炎性反應等眾多因素參與了PD 的發生發展過程[1-2]。近年來多項研究發現腸道微生物通過腦-腸軸影響神經系統調節，與PD 存在密切聯系[3]。雖然PD 的發病機制研究有了長足的進步，但目前仍無切實有效的治療手段，無論藥物或手術，均只能改善癥狀，不能有效地阻止病情的發展，更無法治愈。

干細胞移植治療PD 是目前的研究熱點，涵蓋了胚胎干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞和誘導多能干細胞等。人臍血單個核細胞（human umbilical cord blood mononuclear cells，hUCB-MNCs）含有一定量干細胞及豐富的神經營養因子，有研究發現其在中風和脊髓損傷等動物模型中發揮很好的治療作用[4-5]，并且本課題組應用hUCB-MNCs 治療多系統萎縮患者取得了良好的治療效果，但其對PD 療效尚無相關報道[6]。本研究采用宮殿榮教授獨創的寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB-MNCs 治療PD患者，并對患者的臨床及隨訪資料進行總結分析，以期為臨床治療PD 提供參考。

資料與方法

一、研究對象

選擇2010年12月至2018年12月聊城市人民醫院神經內科應用寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB- MNCs 治療的31例PD患者。其中男19例，女12例；年齡51～73歲，平均（63.5±7.2）歲；病程5～12年，中位時間為8年；服用左旋多巴等效劑量405～1500 mg/d，平均（629.57±205.33）mg/d。入組標準：（1）符合英國腦庫PD 診斷標準；（2）診斷原發性PD ≥5年；（3）對左旋多巴藥物有反應性，現藥效逐漸減退，或出現藥物治療無效的癥狀波動（開關現象）和（或）異動癥。排除標準：（1）各種繼發性帕金森綜合征、帕金森疊加綜合征以及其他非原發性PD；（2）既往曾接受PD 手術治療（包括腦深部電刺激術和毀損術）；（3）合并嚴重心腦血管疾病或者消化、呼吸、血液等其他系統重大疾??；（4）合并有腫瘤或者既往腫瘤病史；（6）合并有其他嚴重神經、精神系統疾病無法合作者。本研究得到醫院倫理委員會批準（批號：2010067）并得到所有受試者或其家屬的知情同意。

二、方法

1.hUCB-MNCs 制備：無菌條件下采集我院產科健康剖宮產產婦志愿捐獻的新鮮臍帶血約150 mL（乙肝五項、丙肝、艾滋病、梅毒等其他相關傳染性指標均呈陰性），經院倫理委員會批準，無倫理學爭議。由我院中心實驗室專業人員用臍帶血處理試劑盒（加拿大威爾森公司研制，寧夏中聯達生物有限公司生產，規格：SCR-200I）分離提取hUCB-MNCs，得到hUCB-MNCs 懸液5 mL [（2～3）×108/mL]，檢測細胞活率≥98 %，立即由0℃～4℃低溫運輸箱送達病房，1 h 內移植到患者體內。

2.hUCB-MNCs 注射：采用寰枕間隙側方穿刺術[7]注射hUCB-MNCs。具體操作如下：患者去枕平臥，頭置正中，頸伸直，取乳突最高點的下、后各1 cm。常規消毒鋪洞巾，局部麻醉，穿刺針與外耳道假想連線平行，與頸椎縱軸垂直，沿枕骨下緣進針，穿刺過程中有2次落空感，一旦出現突破感，拔出針芯有腦脊液流出，即進入枕大池，為穿刺成功。留取腦脊液送檢，將已經復溫處理的hUCB-MNCs 5 mL緩慢注入枕大池，拔出穿刺針，按壓穿刺點，無菌敷料覆蓋。操作過程嚴格遵循無菌原則，術后患者去枕臥位6～8 h。

3.評價方法：統計患者的性別、年齡、病程及左旋多巴等效劑量（levodopa equivalent dose，LED）。LED 的換算公式如下：100 mg 左旋多巴 = 125 mg多巴絲肼 = 100 mg 吡貝地爾 = 100 mg 金剛烷胺 =1 mg 普拉克索 = 5 mg 羅匹尼羅 = 10 mg 司來吉蘭 =133 mg 卡左雙多巴。采用統一帕金森評估量表（unified Parkinson disease rating scale，UPDRS）第Ⅱ部分、第Ⅲ部分、帕金森非運動癥狀評價量表（the non-motor symptoms scale for Parkinson's disease，NMSS）、匹茲堡睡眠質量指數量表（Pittsburgh sleep quality index，PSQI），對患者治療前及治療后1、3、6、12個月進行評分，所有評估項目均在藥物“ 開”的條件下進行，即患者服用左旋多巴制劑后藥效達到最佳狀態下的情況。所有項目的評估均由不參加治療的、有經驗的神經內科醫生獨立完成。

三、統計學分析方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，UPDRSⅡ/Ⅲ、NMSS、PSOI 評分及左旋多巴等效劑量采用Shapiro-Wilk 檢驗，所有變量符合正態分布以x±s表示，采用重復測量方差分析對治療前后多個時間點的評分進行比較，各個時間點評分的兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、經寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB-MNCs治療對PD患者UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分的影響

由重復測量方差分析結果可知，不同時間的UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分差異有統計學意義（P＜ 0.05）。不同時間點的兩兩比較顯示，與治療前比較，治療后3、6、12個月UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分均下降，差異具有統計學意義（P＜ 0.05，表1）。

二、經寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB-MNCs治療對PD患者非運動功能的影響

由重復測量方差分析結果可知，不同時間的NMSS 評分及PSOI 評分差異有統計學意義（P＜0.05）。不同時間點的兩兩比較顯示，與治療前比較，治療后1、3、6、12個月NMSS 及PSOI 評分均下降，差異具有統計學意義（P＜ 0.05，表2）。

三、經寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB-MNCs治療對PD患者左旋多巴等效劑量的影響

由重復測量方差分析結果可知，不同時間的LED 差異有統計學意義（P＜ 0.05）。不同時間點的兩兩比較顯示，與治療前比較，治療后6、12個月LED 下降，差異具有統計學意義（P＜ 0.05，表2）。

四、治療后不良反應

3例患者治療后數小時開始出現發熱，體溫最高38℃，未予特殊處理，24 h 內體溫逐漸恢復正常。2例患者治療后出現頭痛，程度輕微，24～48 h 內逐漸緩解。其余 患者在術中及術后均無特殊不適感。所有患者成功隨訪1年，均未出現出血、感染等穿刺移植相關并發癥。

討 論

據統計，全球現有約580 萬PD患者，而我國患者人數約為260 萬，居世界第一[8]。老年人群PD 發病率較高，隨著社會老齡化的加重，我國PD患者將會逐年增多，極大地影響了患者的生活質量，給社會帶來沉重的負擔。因此，探索有效的治療方法具有十分重要的意義。

干細胞移植是目前PD 治療研究的熱點，這其中包括神經干細胞、胚胎的多巴胺能神經元移植，但因倫理學爭議等一系列問題，限制了其在臨床中的應用[9-10]。一項前瞻性研究對7例PD患者側腦室立體定向注射自體骨髓間充質干細胞，術后隨訪觀察10～36個月，發現3例患者的UPDRS 評分持續改善，2例患者的左旋多巴等效劑量明顯減少[11]。但是，骨髓間充質干細胞取材相對困難、細胞產率低。因此探索用于治療PD 的其他細胞來源成為重要問題。

表1 寰枕間隙側方穿刺術移植臍血單個核細胞治療前后UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分比較（分，± s）

表1 寰枕間隙側方穿刺術移植臍血單個核細胞治療前后UPDRS Ⅱ、Ⅲ評分比較（分，± s）

項目例數 治療前治療后F 值 P 值1個月 3個月 6個月 12個月UPDRS Ⅱ 31 17.75± 6.81 15.38± 6.14 13.67± 5.62 12.54±4.39 10.41±4.31 4.101 0.013 UPDRS Ⅲ 31 28.53±14.75 26.36±14.03 21.65±10.11 19.37±9.26 16.12±7.44 5.237 0.006

表2 寰枕間隙側方穿刺術移植臍血單個核細胞治療前后NMSS、PSOI 評分和LED 比較（± s）

表2 寰枕間隙側方穿刺術移植臍血單個核細胞治療前后NMSS、PSOI 評分和LED 比較（± s）

項目例數 治療前治療后F 值 P 值1個月 3個月 6個月 12個月NMSS（分）31 58.94±35.74 50.27± 31.06 41.38± 28.25 38.42± 25.73 36.15± 24.56 6.375 0.000 PSOI（分）31 11.68± 5.27 6.53± 4.92 3.68± 2.45 2.87± 1.63 2.14± 1.02 7.428 0.000 LED（mg/d）31 629.57±205.33 593.35±194.82 551.36±190.14 435.54±160.62 300.71±135.83 4.061 0.015

hUCB-MNCs 來源豐富，免疫原性低，可以直接用于異體移植，對供者沒有傷害[12]。hUCB-MNCs含有一定量的干細胞及豐富的神經營養因子[13-14]，這使得其成為一種可以治療神經退行性疾病很有潛力的細胞。有研究表明，與hUCB-MNCs 有相似來源的臍帶間充質干細胞移植后可改善PD 模型鼠的行為學障礙，而且能夠減少腦內神經元的損傷[15]。Karlupia 等[16]研究發現，相較于臍帶間充質干細胞，hUCB-MNCs 治療更有利于缺血性腦卒中神經缺損功能恢復。由此，筆者團隊對hUCB-MNCs 移植對PD 的治療效果進行了深入探索。

本研究的另一項優勢在于細胞治療途徑。目前中樞神經系統疾病的細胞治療途徑主要有靜脈輸注、側腦室穿刺、腰椎穿刺和立體定向移植等，但均存在不同缺點。宮殿榮教授國際首創寰枕間隙側方穿刺術（宮氏穿刺法），并將其作為hUCB-MNCs 移植的獨特途徑，目前已成功完成1 000 余人次穿刺，證明了其有效性和安全性[7]。理論上，寰枕間隙側方穿刺術將細胞導入枕大池，在內源性遷移途徑的引導下到達目標區域，避免直接植入損傷區炎性環境影響移植細胞的存活[17]，亦避免了細胞經靜脈治療途徑中的肺部清除及腰椎穿刺注入的細胞在各神經根處丟失[18]。枕大池與第四腦室直接相通，寰枕間隙側方穿刺治療既可以達到側腦室穿刺治療同等效果，又能減少手術創傷和并發癥[19]。

應用便捷易獲得的hUCB-MNCs，結合獨特的細胞移植途徑，針對PD 取得了良好的治療效果。本研究結果顯示，經寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB- MNCs 治療后3個月，PD患者的運動功能評分改善，提高了患者的日常生活能力，于治療后6個月左旋多巴等效劑量明顯減少。PD 除表現為運動障礙外，同時可伴有心血管系統障礙、泌尿系障礙、性功能障礙、情緒與認知障礙等非運動癥狀，睡眠障礙在PD患者中亦很常見，文獻報道PD患者睡眠障礙的發生率為75 %～98 %[20]，這些非運動癥狀因為嚴重影響患者生活質量而受到研究者越來越多的關注。目前的藥物及手術治療均致力于改善患者的運動障礙，對非運動癥狀收效甚微。然而，本研究發現PD患者經寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB- MNCs治療后1個月NMSS 及PSOI 評分均較治療前顯著下降，并在12個月的隨訪期間進行性改善，這提示經寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB-MNCs 治療對于PD患者非運動癥狀起效較快，并且療效顯著持久。目前其治療機制尚不明確，推測其通過激活內源性神經干細胞、改善腦內微環境、調節免疫機制和促進多種神經營養因子分泌等機制發揮治療作用[21-22]。

綜上所述，對于PD患者，寰枕間隙側方穿刺術移植hUCB-MNCs 治療是一種有效的方法，尤其對于非運動癥狀起效快而顯著。本研究納入病例數較少，存在一定局限性，尚需擴大樣本量，進行多中心的隨機對照研究以進一步驗證其療效。