TCF21缺失表達對卵巢癌惡性生物學行為的影響

賈 莉，聞洪麗

重慶市中醫院婦科，重慶 400021

卵巢癌是指包括病因學、分子生物學和許多其他特征均不同的一系列異質性惡性腫瘤，是最常見的婦科惡性腫瘤之一，僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，其惡性程度最高，病死率也最高[1]。90%的卵巢癌來源于卵巢上皮，最常見的是漿液性癌。大多數漿液性卵巢癌在診斷時已為Ⅲ期(51%)或Ⅳ期(29%)，其5年病因特異性存活率分別為42%和26%[2]。轉錄因子21(TCF21)是SMITH等依據染色體雜合性缺失的定位研究在人染色體6q23～6q24上發現的新的腫瘤抑癌基因，它是堿性螺旋-環-螺旋家族的一個轉錄因子，其高表達在器官的間質細胞中，比如肺、腎、腸、心臟及腎臟的腎小球上皮細胞。TCF21在多種腫瘤中因存在啟動子區異常甲基化而導致其在不同腫瘤組織中表達缺失，比如透明細胞腎癌、乳腺癌、肺癌、頭頸部腫瘤、胃癌、膀胱癌等[3-4]。有研究表明，TCF21能夠對細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲產生抑制作用[5]，但在卵巢癌中的研究極少。因此，本研究分析了TCF21在卵巢癌中的表達及臨床意義，同時通過在人卵巢癌HEY細胞中過表達TCF21和體內外試驗驗證其對卵巢癌細胞惡性生物學行為的影響，進一步探討其作為候選生物標志物在卵巢癌的治療中的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 反轉錄及PCR試劑盒、PCR引物購于Takara公司；TCF21過表達慢病毒載體由上海吉凱基因公司合成并構建；免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術公司；兔抗人TCF21抗體及小鼠抗人GAPDH抗體均購自Abcam公司。

1.1.2組織標本 所有組織標本來源于2017年1月至2018年12月本院婦科手術患者，均簽署知情同意書且病理診斷證實為高級別低分化漿液性卵巢癌，術前均未接受過放療和化療；卵巢癌HEY細胞株為重慶市腫瘤醫院實驗研究中心贈送。

1.2方法

1.2.1細胞及細胞培養 HEY卵巢癌細胞株用完全培養基(含10%胎牛血清的RPMI-1640)在37 ℃、5% CO2條件下培養。

1.2.2慢病毒轉染并篩選穩定株 將細胞分為兩組：第1組為轉染Lenti-TCF21組(過表達組)，第2組為轉染空載體病毒組(空載體組)。轉染流程按照上海吉凱基因公司說明書執行。根據實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)結果選取較低表達呈對數生長期的HEY細胞(5×104/mL)加入6孔板，于37 ℃孵育箱培養12 h貼壁后，感染復數為30，轉染72 h后熒光最強，收集此時的細胞用2.5 mg/mL嘌呤霉素處理，1周后篩選穩定表達株。將細胞穩定表達株分為HEY陰性對照組(HEY NC)和HEY TCF21過表達組(HEY TCF21)。

1.2.3細胞株氮雜胞苷(Aza)處理 所有野生型細胞株均經過10 mmol/L的5-Aza處理72 h后提取mRNA，保存于-80 ℃待后續試驗。

1.2.4熒光定量PCR 本研究采用Takara公司的Trizol試劑、cDNA二步法反轉錄試劑盒和Takara SYBR Green Ⅰ試劑盒提取組織和細胞株總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。使用Takara公司的SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ進行熒光定量PCR檢測TCF21 mRNA的表達，以GAPDH作為內參。TCF21上游引物為5′-TCCTGGCTAACGACAAATACGA-3′，下游引物為5′-TTTCCCGGCCACCATAAAGG-3′；GAPDH上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。PCR擴增反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT公式計算目的基因mRNA的相對表達量。試驗獨立重復3次。

1.2.5免疫組織化學 所有標本經固定、包埋和切片后按照免疫組織化學SP試劑盒說明書進行操作，TCF21多克隆抗體以1∶100稀釋，嚴格控制各步驟的時間及溫度，各組均以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。TCF21以細胞質和細胞膜染色呈棕褐色作為陽性細胞標準。所有切片均采用H-Score法分析，根據每張切片的染色強度及范圍計算并分析。使用正置顯微鏡(Axio Imager A2,Carl Zeiss Microscopy GmbH)采集圖像。

1.2.6Western blot試驗 RIPA細胞裂解液于冰上裂解細胞，裂解產物經過離心及蛋白變性后加入Loading buffer上樣至SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離，后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入兔抗人TCF21抗體(1∶1 000)和小鼠抗人GAPDH抗體(1∶300)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，最后用化學發光法顯影。使用Fusion軟件分析灰度值：目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值=相對表達量。試驗獨立重復3次以上。

1.2.7克隆形成試驗 取對數生長期HEY TCF21細胞及HEY NC細胞，按500個/孔的數目種入6孔板內，加入新鮮完全培養基2 mL于37 ℃孵育箱培養12 d后取出，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3次，結晶紫染色后將6孔板正置于掃描儀下，掃描計數克隆團并分析，以細胞>50個為1個克隆團,克隆形成率=平均克隆數/500×100%。所有試驗均獨立重復3次以上。

1.2.8Transwell試驗檢測HEY細胞遷移、侵襲能力 (1)Transwell細胞遷移。①制備：制備細胞懸液;②接種:取小室(上室)置于24孔板中，加入1×105個細胞，加入400 μL培養基，在24孔板內(下室)加入培養基600 μL;③培養:細胞孵育箱內培養10 h(HEY細胞培養6 h)，取出孔板倒置顯微鏡下觀察下室有細胞出現說明上室內細胞已遷移出來;④固定染色：取出小室，棉簽擦去上室細胞，PBS浸泡洗滌1次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，倒置顯微鏡下觀察上室，保證細胞擦凈，小室膜面浸沒于結晶紫染料中20 min，PBS洗滌;⑤封片計數：染色成功后，用棉簽擦去上室液體，待膜干燥，用刀片削下膜，中性樹脂固定膜于載玻片上，細胞面朝下，蓋玻片封片，顯微鏡下照相并計數。(2)Transwell細胞侵襲。①制膠：Matrigel基質膠稀釋后包被于Transwell小室上室面，37 ℃孵育2 h使其成為凝膠狀;②制備:制備細胞懸液;③接種：向已被覆Matrigel的Transwell小室上室中加入含2×105個細胞的0.2 mL無血清培養基，小室外孔內加入0.7 mL含10%胎牛血清的培養基;④培養：孵育箱孵育48 h后，取出小室，小心吸盡上室中液體;⑤固定染色：5%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色液染色20 min，PBS清洗2次后風干;⑥封片計數：顯微鏡下隨機選取5個視野(×400)拍照計數。

1.2.9皮下移植瘤模型建立 選取購于重慶市腫瘤醫院實驗動物研究中心大約4周齡、體質量約20 g的雌性裸鼠。取對數生長期HEY TCF21細胞及HEY NC細胞，PBS調整細胞為5×107/mL。實驗中每組5只裸鼠,分別于臀部常規聚維酮碘消毒后皮下注射100 μL HEY TCF21細胞(TCF21過表達組)和HEY NC細胞(對照組)懸液。此后每間隔5 d使用游標卡尺測量腫瘤大小(長徑及短徑)，觀察并記錄皮下瘤瘤體生長情況，皮下瘤體積根據公式:π/6×長徑×短徑2。5周后剖出新鮮皮下瘤拍照、測量、稱重后固定于甲醛中，常規石蠟包埋、切片后用于后續試驗。

2 結 果

2.1TCF21在卵巢癌組織和細胞株中的表達 qRT-PCR檢測結果顯示，TCF21 mRNA在卵巢癌細胞株及10例高級別漿液性卵巢癌組織中的表達水平均較正常卵巢組織低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1A、圖1B；免疫組織化學檢測結果顯示， TCF21在高級別漿液性卵巢癌組織中的蛋白表達水平明顯低于正常卵巢和正常輸卵管組織，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1C、圖1D。

注：A為TCF21 mRNA在正常卵巢組織及卵巢癌細胞株中的相對表達水平，NOR表示正常卵巢組織，3AO、HEY、8910、OVCAR3、A2780分別表示卵巢癌細胞株3AO、HEY、8910、OVCAR3、A2780;B為TCF21 mRNA在正常卵巢組織及10例高級別漿液性卵巢癌組織中的相對表達水平，1～3表示3例正常卵巢組織，1～10表示10例高級別漿液性卵巢癌組織；C為TCF21在正常卵巢組織、正常輸卵管組織和高級別漿液性卵巢癌組織中的蛋白表達水平；D為免疫組織化學評分，1表示正常卵巢組織(n=5)，2表示正常輸卵管組織(n=3)，3表示高級別漿液性卵巢癌組織(n=30)；與其他類別比較，*P<0.05。圖1 TCF21在正常卵巢和正常輸卵管組織及卵巢癌組織中mRNA和蛋白表達水平

2.2DNA甲基化影響卵巢癌細胞中TCF21的表達 多種腫瘤中TCF21低表達是由于基因啟動子DNA甲基化所導致。本研究通過對目的細胞株進行Aza藥物去甲基化處理后，qRT-PCR檢測結果顯示，與未處理組比較，使用Aza處理后TCF21的mRNA表達均增強，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3HEY細胞株轉染Lenti-TCF21慢病毒后的表達驗證 根據圖1篩選相對表達水平較低的HEY細胞株作為后續試驗細胞株，將細胞分為過表達組和空載體組。qRT-PCR和Western blot試驗證實，過表達組TCF21 mRNA及蛋白表達水平均明顯高于空載體組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4過表達TCF21抑制HEY細胞克隆形成能力 采用平板克隆法進行細胞增殖試驗檢測結果顯示，過表達TCF21后卵巢癌細胞克隆灶形成率明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2A、圖2B。

注：A為過表達TCF21抑制HEY細胞克隆形成;B為過表達TCF21抑制HEY細胞克隆形成率；與HEY TCF21比較，*P<0.05。圖2 平板克隆法檢測過表達TCF21對卵巢癌細胞克隆形成能力的影響

2.5TCF21抑制卵巢癌細胞在體內的增殖能力 成功建立裸鼠皮下移植瘤模型，5周后獲取皮下瘤體拍照繪制皮下瘤體積的生長曲線，發現與對照組比較，TCF21過表達組皮下瘤的瘤體大小、質量明顯縮小/減輕。對皮下瘤體進行免疫組織化學檢測TCF21，驗證過表達模型的成功建立和Ki-67的表達，以評估細胞的增殖能力，結果顯示，過表達TCF21組皮下瘤體Ki-67的表達水平明顯降低?？傮w結果顯示TCF21能抑制卵巢癌細胞的體內成瘤能力。

2.6過表達TCF21抑制HEY細胞遷移和侵襲能力 Transwell試驗檢測HEY細胞遷移和侵襲結果顯示，與HEY TCF21比較，過表達TCF21可明顯減弱HEY細胞的遷移[(58.33±3.68)個vs. (317.70±5.04)個]和侵襲能力[(77.30±2.79)個vs. (187.80±4.70)個]，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為Transwell試驗檢測HEY TCF21和HEY NC細胞的遷移和侵襲；B為遷移細胞數；C為侵襲細胞數；與HEY TCF21比較，*P<0.05。圖3 Transwell試驗檢測TCF21對HEY細胞遷移和侵襲的影響(倒置熒光顯微鏡×400)

3 討 論

在全球范圍內，卵巢癌是女性第七大最常見的癌癥，也是第八大最常見的癌癥死亡原因，其5年生存率低于45%[5]。2018年，美國新診斷出卵巢癌病例約22 240例，死亡14 070例。盡管進行了廣泛的臨床和基礎研究，由于早期難以發現，60%的卵巢癌患者在診斷時已處于晚期，5年生存率僅為27%。因此，早期發現和預防是研究的重點，因為局部疾病的5年相對生存率為93%[6]。

表觀遺傳學修飾中啟動子甲基化被認為是基因在腫瘤發展早期階段的重要機制之一。有研究表明，TCF21在不同類型腫瘤中的缺失表達均與其啟動子區域甲基化相關，比如小細胞肺癌[7]。DAI等[8]對TCF21的作用調控機制進行了研究，發現缺氧腫瘤微環境能直接激活多種microRNA的表達，直接與SLC12A1和TCF21 2個靶點結合并導致這2個基因表達下調。本研究發現，TCF21在卵巢癌細胞及其組織中呈明顯缺失表達狀態，藥物去甲基化處理后，TCF21基因表達水平明顯恢復，且體內外細胞學試驗證明其表達的恢復明顯抑制其惡性生物學行為(惡性增殖、遷移、侵襲)，所有結果與目前已知在其余腫瘤類型中的研究結果一致。TCF21的重要功能是促進間質細胞向上皮細胞轉化，而上皮細胞向間質細胞轉化則與惡性腫瘤的遷移和侵襲相關。最新研究表明，TCF21通過調控AKT信號通路抑制胃癌細胞的增殖和對順鉑耐藥[9],靶向調控PI3K/AKT and ERK信號通路可抑制腫瘤相關血管生成，以及膽管癌、直腸癌細胞生長[10],并且可能抑制自噬活性，促進肺癌進展[11]。TCF21缺失表達與不同類型腫瘤的不良預后明顯相關，如黑色素瘤、腎癌、肝癌、頭頸部鱗癌[12]。TCF21在卵巢癌中的研究較少，有研究表明，miR-205通過靶向TCF21對卵巢癌有重要作用，TCF21可抑制基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-10，并減少卵巢癌細胞的侵襲，共同轉染表達TCF21質粒與miR-205可降低TCF21對卵巢癌細胞MMP-2和MMP-10的抑制作用[13]。TCF21在卵巢癌中的功能及機制研究極少。

綜上所述，TCF21缺失表達與多種腫瘤密切相關，使TCF21作為腫瘤早期檢測的腫瘤標志物成為可能。卵巢癌的發生可能與6號染色體區域6q22和6q23～6q24的雜合型缺失相關，而TCF21位于相同基因位置。本研究在TCF21的表達及基礎生物學行為方面做了簡單探討，而TCF21的表達下調是否可作為篩查卵巢癌早期的生物標志物，是否對卵巢癌的耐藥、自噬和預后等有影響，需要進一步加大臨床組織標本進行臨床特征的分析和試驗佐證。