基于網絡藥理學技術研究黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結腸炎的作用機制

郝方嘉，彭媛媛，趙琳靜

（上海工程技術大學 化學化工學院,上海 201620）

潰瘍性結腸炎 (Ulcerative Colitis，UC) 是一種由多種因素引起的炎癥性腸病，臨床主要表現為持續性或反復性發作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便等[1]，病況反復遷延，且有癌變風險[2].目前，關于潰瘍性結腸炎的發病機制尚不明確，通常認為與遺傳和環境因素引起的腸道微生物組成變化和腸黏膜屏障損傷有關.現有的治療藥物主要包括柳氮磺吡啶水楊酸制劑、糖皮質激素和免疫抑制劑[3].這些藥物可以暫時緩解癥狀，但是容易引起消化道出血、皮疹、代謝紊亂、白內障、青光眼等多種副作用，此外還可能引發一系列感染.

潰瘍性結腸炎屬中醫學“痢疾”范疇.中醫藥療法在促進腸黏膜恢復、緩解臨床癥狀、減少復發方面有獨特優勢.據文獻報道，在我國有超過20%的潰瘍性結腸炎患者采用純中藥治療，59%患者采用中西醫結合治療[4].Zhao 等[5]研究發現，補氣養陰類民間經方黃芪?枸杞子藥對可顯著改善潰瘍性結腸炎大鼠體重、腹瀉及結腸黏膜損傷，有效促進腸上皮細胞增殖.但由于化學成分復雜，關于黃芪?枸杞子配伍治療潰瘍性結腸炎的作用機制尚未見報道.

網絡藥理學 (network pharmacology)[6]是基于系統生物學理論，通過對生物系統的網絡分析，從整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發現的新學科.相比以往“一個藥物、一種基因、一種疾病”的新藥研發模式，網絡藥理學技術為多成分、多靶點、多通路互作的復雜藥物的作用和機制研究提供了強有力的手段[7].本研究運用網絡藥理學技術，系統挖掘黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結腸炎的關鍵靶點和相關信號通路，探討可能的作用機制，為兩藥配伍抗潰瘍性結腸炎的循證研究提供參考數據.

1 數據來源與方法

1.1 中藥化學成分及候選靶點

通過整合藥理學平臺(Integrative Pharmacologybased Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP)(http://www.tcmip.cn/)[8?9]的“中藥材數據庫”“中藥成分數據庫”“中藥靶標數據庫”“疾病相關分子庫”等數據庫資源，檢索中藥黃芪和枸杞子所有化學成分及相關靶點，并收集潰瘍性結腸炎相關基因和蛋白靶點，對中藥成分及相關靶點進行功能分析.以兩倍“節點連接度”中位數為卡值，選取中藥成分靶標和疾病基因互作網絡的核心節點，根據“節點連接度”“節點緊密度”“節點介度”3 個拓撲結構特征值，篩選黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結腸炎的關鍵作用靶標.

1.2 蛋白互作網絡構建

通過 Uniprot 數據庫 (http://www.uniprot.org/)對收集的基因信息和蛋白靶點進行校正，物種設置為 Human，獲得各靶點的Uniprot ID.將上述靶點導入String 數據庫(https://string-db.org/)，獲得關鍵靶點蛋白互作 (Protein-Protein Interactive,PPI) 關系數據，進一步利用 Cytoscape 3.7.1 軟件(https://cytoscape.org/) 構建PPI 可視化網絡.

1.3 基因功能和信號通路富集分析

將黃芪?枸杞子配伍調控潰瘍性結腸炎的關鍵靶點導入DAVID 數據庫 (https://david.ncifcrf.gov/)，設置物種及背景為Homo sapiens (Human)，進行基因本體(Gene Ontology，GO) 功能富集和京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 信號通路富集分析，獲得黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結腸炎關鍵網絡靶標的基因功能及參與的信號通路.

GO 富集分析主要包括生物過程 (Biological Process，BP)、細胞組成 (Cellular Component，CC)和分子功能 (Molecular Function，MF) 3 個部分，分別按照p值篩選排名前30 位的條目進行分析.KEGG 富集分析按照p值選取排名前 30 位的條目進行分析，并將富集分析結果可視化.

1.4 “中藥?核心成分?關鍵靶點?主要通路”多維調控網絡構建

利用 TCMIP 平臺的網絡藥理學計算模塊，構建“中藥?核心成分?關鍵靶點?主要通路”多維調控網絡，挖掘黃芪?枸杞子配伍抗潰瘍性結腸炎的關鍵靶點和主要信號通路.

2 結果

2.1 黃芪?枸杞子藥對的化學成分及候選靶標篩選

本研究收集黃芪和枸杞子化學成分共計89 個.黃芪中29 種化學成分對應基因和蛋白靶點77 個，枸杞子中60 種化學成分對應蛋白靶點229 個，其中，23 種蛋白靶點為兩藥共有靶點.對中藥成分潛在靶標的基因功能進行分析，發現主要涉及氧化還原過程、線粒體、內質網膜、L?抗壞血酸結合、鐵離子結合、胞外甘氨酸門控氯通道活性、磷脂及磷脂酰膽堿生物合成等.

2.2 黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結腸炎的候選靶標相互作用分析

利用TCMIP 數據庫的網絡計算技術，根據網絡拓撲特征值，篩選黃芪?枸杞子抗潰瘍性結腸炎的候選靶標，構建候選靶標相互作用網絡，如圖1所示.此網絡中包含146 個節點和510 條邊，分別代表候選靶標及其相互作用.節點大小代表連接度 (degree)大小.表1 顯示了連接度 >10 的23 個關鍵靶標的網絡拓撲特征參數.

表1 黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結腸炎關鍵靶標的網絡拓撲特征參數Table 1 Network topological parameters of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

圖1 黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結腸炎的候選靶標相互作用網絡Fig.1 Candidate target interaction network of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.3 GO 功能富集分析

通過DAVID 數據庫對2.2 中描述的關鍵靶標進行 GO 功能富集分析.以p<0.05、FDR <0.05 為篩選條件，共獲得BP 相關條目217 個，CC 相關條目20 個，以及MF 相關條目43 個.各取排名前10 位的條目，結果如圖2 所示.BP 相關前10 位條目主要涉及凋亡過程負調控、蛋白質磷酸化、G 蛋白偶聯受體信號通路等；CC 相關前 10 位條目主要涉及質膜、核質等；MF 相關前10 位條目主要涉及ATP 結合、蛋白激酶活性、轉錄因子結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等.

圖2 黃芪?枸杞子治療潰瘍性結腸炎關鍵靶標的GO 功能富集分析圖Fig.2 GO network enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.4 KEGG 通路富集分析

對黃芪?枸杞子抗潰瘍性結腸炎的關鍵靶標進行 KEGG 通路富集分析，以p<0.05、FDR <0.05 為篩選條件，共獲得相關信號通路125 個.按照p值取前30 個重要通路，結果如圖3 所示.主要涉及趨化因子信號通路、PI3K-Akt 信號通路、JAK/STAT 信號通路、Toll 樣 受 體 (Toll-Like Receptors,TLRs) 信號通路、腫瘤壞死因子 (TNF)信號通路、核轉錄因子 (NF-κB) 信號通路、HIF-1信號通路等重要免疫和炎癥相關通路.此外，也與一些癌癥通路、cGMP-PKG 信號通路、鞘脂類信號通路、雌激素信號通路等有關.

圖3 黃芪?枸杞子治療潰瘍性結腸炎關鍵靶標的KEGG 通路富集分析圖Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.5 “中藥?核心成分?關鍵靶點?主要通路”多維調控網絡分析

黃芪?枸杞子治療潰瘍性結腸炎的“中藥?核心成分?關鍵靶點?主要通路”相互作用網絡如圖4所示.此網絡中包含40 個節點和74 條邊，涉及9 個潛在活性成分、11 個作用靶點及18 個信號通路.結果表明，黃芪?枸杞子藥對活性成分可通過作用于磷脂酶D1/2 (PLD1/2)、前列腺素 G/H 合成酶 1/2 (PTGS1/2)、過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARG)、趨化因子CCL8、腺苷A3 受體 (ADORA3) 等關鍵靶點，參與NF-κB、TNF、趨化因子、T細胞受體 (TCR)、B 細胞受體 (BCR) 等免疫和炎癥相關重要信號通路，發揮治療潰瘍性結腸炎作用.

圖4 “中藥?核心成分?關鍵靶點?主要通路”多維調控網絡關系圖Fig.4 "Herb-composition-target-pathway" multidimensional network diagram

3 結語

本研究基于網絡藥理學方法，研究黃芪?枸杞子藥對治療潰瘍性結腸炎的活性成分和可能的作用機制，結果顯示兩藥配伍可能通過調節多個免疫和炎癥相關信號通路發揮抗UC 作用.黃芪中活性成分毛蕊異黃酮 (Calycosin)、異鼠李素(Isorhamnetin) 等可作用于PTGS2 發揮治療潰瘍性結腸炎作用[10]；PTGS2 (COX-2) 是一種可誘導酶，介導前列腺素的合成，在炎癥反應中起著重要的作用.實驗研究證實，黃芪多糖也可減少調節核因子-κB (NF-κВ) DNA 磷酸化活性，并下調腫瘤壞死因子 (TNF-α) 和白介素 (IL-1β,IL-6,IL-17) 等多種炎癥因子表達[11].同時，研究表明枸杞子提取物可降低右旋糖酐硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠的趨化因子 (C-X-C motif) 配體1 和單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1) 以及炎癥介質白介素-6 (IL-6) 和環氧化酶-2 (COX-2) 表達[12].Sharma 等[13?14]報道了枸杞子提取物通過NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 等信號通路和激酶的表達，抑制腸道炎癥，促進腸黏膜損傷修復.這些研究從不同角度驗證了本研究發現.后續將基于網絡藥理學分析結果，對篩選出的關鍵靶點和信號通路繼續開展細胞及動物水平的實驗驗證，全面揭示黃芪?枸杞子配伍通過調節炎癥與免疫治療潰瘍性結腸炎的分子機制，為中醫藥抗潰瘍性結腸炎的基礎和臨床研究提供科學數據.