血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶9、基質金屬蛋白酶2與垂體瘤卒中及垂體瘤頭痛的關系研究

金濤，周躍飛，王晰，楊西愛，陳鶴鳴

近年垂體瘤發病率逐漸升高，其可引發頭痛、內分泌失調等癥狀；垂體瘤卒中是垂體瘤梗死或出血所導致的一組綜合征，具有發病急、癥狀嚴重、病情進展快的特點［1］。目前，垂體瘤卒中的發生發展機制仍未完全明確。血管內皮生長因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）不僅可介導血管新生，還可促進內皮細胞遷移、增加血管通透性并參與腫瘤細胞的侵襲及遷移［2］； 基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-9和MMP-2對基膜具有較強的降解作用，與多種惡性腫瘤的浸潤和遷移有關［3］。頭痛雖是垂體瘤及垂體瘤卒中的共有癥狀，但并非發生于所有患者［4］。本研究分析VEGF、MMP-9、MMP-2與垂體瘤卒中及垂體瘤頭痛的關系，以為臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月—2018年5月在安康市中心醫院進行手術治療的100例垂體瘤患者的病理組織標本?；颊呒{入標準：（1）經影像學檢查顯示鞍區占位病變，且經病理學檢查確診為垂體瘤；（2）首次接受手術。排除標準：（1）臨床資料不全者；（2）既往有神經性頭痛、血管性頭痛等其他明確病因所致慢性頭痛者；（3）其他部位、系統腫瘤患者；（4）既往接受激素治療者；（5）嚴重心、肝、腎、肺等臟器功能衰竭者；（6）凝血功能障礙者。根據垂體瘤卒中發生情況將所有患者分為觀察組（發生垂體瘤卒中）和對照組（未發生垂體瘤卒中），各50例。兩組患者性別、年齡、病理類型、腺瘤分型、頭痛發生率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。本研究經安康市中心醫院倫理委員會審核批準（編號：論201806），并獲得患者或家屬知情同意。

表1 兩組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information between the two groups

1.2 垂體瘤卒中的診斷標準［5］出現新發頭痛癥狀或原有頭痛癥狀加重，或突發惡心嘔吐、視功能障礙、眼肌麻痹甚至意識不清等癥狀；CT、磁共振成像（MRI）等影像學檢查顯示鞍區占位病變且密度不均；術中在瘤內見陳舊性出血或壞死組織。

1.3 方法

1.3.1 VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學染色方法 取石蠟包埋的垂體瘤標本進行連續切片，厚度為4 μm，隔5取1，每個腫瘤組織取9張切片后隨機取其中3張，分別進行VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學染色：將腫瘤組織切片經二甲苯常規脫蠟、乙醇溶液透明，經3%過氧化氫去除過氧化物酶，而后分別滴加Ⅰ抗（分別為兔抗人VEGF多克隆抗體、鼠抗人MMP-9多克隆抗體、鼠抗人MMP-2多克隆抗體），反應過夜后滴加Ⅱ抗，再進行DAB染色、蘇木素復染，最后在光鏡下觀察染色結果。

1.3.2 免疫反應評分（immunorective score，IRS）［6］分別對VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學染色強度進行評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。其中陽性染色范圍評分：每張切片中隨機選擇5個視野（×400），計數100個腫瘤細胞并統計陽性細胞數，5個視野平均陽性細胞數即該片陽性細胞百分比，隨后進行記分（＜5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分）。IRS=染色強度評分×染色范圍評分。

1.4 觀察指標 （1）觀察兩組 VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學染色情況，并比較兩組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS。（2）根據患者垂體瘤頭痛發生情況分為頭痛67例和非頭痛33例，比較頭痛和非頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS。

1.5 統計學方法 應用SPSS 21.0統計學軟件進行數據處理。計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料以（± s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料采用M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；垂體瘤卒中及垂體瘤頭痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS之間的關系采用Spearman秩相關分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線以分析VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS對垂體瘤卒中的預測價值，各曲線下面積（AUC）的比較采用Hanley-McNeil檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和對照組垂體瘤標本的VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學染色情況 垂體瘤標本HE染色見圖1A。與免疫組織化學染色陰性對照（見圖1B）比較，VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學陽性染色均呈棕黃色，主要表達于腫瘤細胞胞質，且觀察組VEGF、MMP-9、MMP-2的染色強度高于對照組，見圖1C～H。

圖1 觀察組和對照組患者垂體瘤標本的VEGF、MMP-9、MMP-2免疫組織化學染色情況（×400）Figure 1 The immunohistochemical staining condition of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in pituitary tumor specimens of observation group and control group

2.2 觀察組和對照組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比較 觀察組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比較〔M（Q1，Q3），分〕Table 2 Comparison of IRS of VEGF，MMP-9，MMP-2 between the two groups

2.3 垂體瘤卒中患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS相關性分析 Spearman秩相關分析結果顯示，垂體瘤卒中患者VEGF的IRS與MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相關（rs值分別為0.433、0.319，P值均＜0.05），MMP-9的IRS與MMP-2的IRS呈正相關（rs=0.471，P＜0.05），見圖2。

圖2 垂體瘤卒中患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS間關系的散點圖Figure 2 Scatter plot of correlation between IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in patients with pituitary apoplexy

2.4 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS對垂體瘤卒中的預測價值 ROC曲線分析結果顯示，VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS預測垂體瘤卒中的AUC分別為0.839〔95%CI（0.754，0.924）〕、0.954〔95%CI（0.914，0.993）〕、0.918〔95%CI（0.862，0.973）〕。MMP-9的IRS預測垂體瘤卒中的AUC大于VEGF的IRS，差異有統計學意義（Z=2.672，P=0.008）；而VEGF的IRS與MMP-2的IRS及MMP-9的IRS與MMP-2的IRS預測垂體瘤卒中的AUC比較，差異無統計學意義（Z=1.630，P=0.103；Z=1.172，P=0.241），見表3、圖3。

表3 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS對垂體瘤卒中的預測價值Table 3 Predictive value of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in pituitary apoplexy

圖3 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS預測垂體瘤卒中的ROC曲線Figure 3 ROC curve of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in predicting pituitary apoplexy

2.5 頭痛與非頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比較 頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9的IRS均高于非頭痛的垂體瘤患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；但頭痛與非頭痛的垂體瘤患者MMP-2的IRS比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 頭痛與非頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比較〔M（Q1，Q3），分〕Table 4 Comparison of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 between headache and non-headache patients with pituitary tumor

2.6 垂體瘤頭痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS間的相關性分析 Spearman秩相關分析結果顯示，垂體瘤頭痛患者VEGF的IRS與MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相關（rs值分別為0.528、0.393，P值均＜0.05），MMP-9的IRS與MMP-2的IRS呈正相關（rs=0.603，P＜0.05），見圖4。

圖4 垂體瘤頭痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS間關系的散點圖Figure 4 Scatter plot of correlation between IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in patients with pituitary tumor headache

3 討論

垂體瘤為常見顱內腫瘤，發病率為10%～15%，且近年呈升高趨勢［7］。垂體瘤梗死或出血可導致垂體瘤卒中，患者表現為突發頭痛或原有頭痛癥狀加重、視覺障礙等，甚至昏迷或死亡［8］。目前，關于垂體瘤卒中的研究多圍繞誘發因素、治療方法等，針對其發生發展機制的研究尚處于起步階段，其分子機制尚未明確［9］。

VEGF不僅能夠通過促進血管內皮細胞增殖而促進血管生成，還具有促進內皮細胞遷移、增加血管通透性的生物學效應，因此其是腫瘤細胞侵襲和轉移的促進因素，并且也參與了垂體瘤的侵襲過程［10-12］。MMP是調節細胞外基質降解的重要酶系，其中MMP-9對基膜的降解能力較強，其高表達不僅與多種惡性腫瘤的浸潤和轉移密切相關［13］，也與垂體瘤免疫逃逸有關［14］，而且VEGF可能協同參與了垂體瘤卒中的發生過程［10］；MMP-2對Ⅳ型膠原蛋白具有特異性降解作用，而Ⅳ型膠原蛋白為細胞外基質的主要組成成分［15］。有研究表明，MMP-9和MMP-2在垂體瘤蝶竇侵襲、海綿竇侵襲中均發揮了重要作用［6，16-18］，且二者可能是垂體瘤卒中的危險因素［19-20］。由于VEGF、MMP-9和MMP-2均與腫瘤血管的通透性及不穩定性有關，且可能均參與了垂體瘤卒中的發生，因此推測VEGF與MMP-9和MMP-2可能協同參與了垂體瘤卒中的發生發展。

本研究結果顯示，觀察組VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS均高于對照組，表明VEGF、MMP-9、MMP-2可能參與了垂體瘤卒中的發生過程。Spearman秩相關分析結果顯示，垂體瘤卒中患者VEGF的IRS與MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相關，MMP-9的IRS與MMP-2的IRS呈正相關，提示MMP-9、MMP-2可能與VEGF協同發揮了促進腫瘤血管新生及破壞新生血管基底膜的作用，進而導致垂體瘤卒中的發生［6］。于明圣等［6］研究表明，垂體瘤卒中患者VEGF、MMP-9的陽性表達水平高于非垂體瘤卒中患者，且二者呈正相關，本研究結果與之一致；VEGF可能通過與Endocan的正反饋機制協同促進了垂體瘤的發展［21］，并通過誘導MMP-9表達共同參與了垂體瘤卒中的發生過程［6］。本研究結果還顯示，MMP-9的IRS預測垂體瘤卒中的AUC大于VEGF的IRS，提示MMP-9對垂體瘤卒中患者具有較高的預測價值。

垂體瘤卒中患者因出血、梗死、水腫導致垂體瘤快速擴張，進而引發頭痛、惡心、視力異常等癥狀，其發生率可分別達87%、80%、34%～56%，高于非垂體瘤卒中患者［4］；然而，仍有部分垂體瘤患者，無論是否發生垂體瘤卒中均無明顯頭痛等癥狀，且其分子機制尚不明確［4］。本研究結果顯示，頭痛的垂體瘤患者VEGF、MMP-9的IRS高于非頭痛的垂體瘤患者，分析原因為：VEGF、MMP-9不僅參與了垂體瘤的形成、遷移及浸潤［5，22-23］，且VEGF可進一步誘導MMP-9表達而導致血管通透性增加、卒中后血腫增大或水腫加劇等［24-26］，因此可能進一步誘發或加重頭痛。本研究結果還顯示，垂體瘤頭痛患者VEGF的IRS與MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相關，MMP-9的IRS與MMP-2的IRS呈正相關，提示垂體瘤頭痛可能與VEGF、MMP-9、MMP-2的相互作用有關。

綜上所述，VEGF與MMP-9、MMP-2可能協同參與了垂體瘤卒中的發生過程，抗VEGF治療、抑制MMP-9與MMP-2或許可成為預防垂體瘤卒中的潛在方法；垂體瘤頭痛可能與VEGF、MMP-9、MMP-2的相互作用有關。但本研究樣本量較少，且對于VEGF、MMP-9、MMP-2的表達情況僅限于病理學層面，未來將采用聚合酶鏈式反應（PCR）及Western blotting等方法進一步驗證上述因子在垂體瘤病理組織中的轉錄及表達情況，且還需進行動物實驗進一步驗證結論。

作者貢獻：金濤、陳鶴鳴進行文章的構思與設計，并對文章整體負責、監督管理；陳鶴鳴進行研究的實施與可行性分析；金濤、王晰、陳鶴鳴進行數據收集、整理、分析；周躍飛進行結果分析與解釋；金濤撰寫論文，并進行論文的修訂；楊西愛負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。