白茶中金花菌的分離與鑒定

吳鳳 鄧有展 秦玉燕 蔣越華 張莉娟 羅義燦 李冬桂

摘 要：金花白茶是白茶中的一種新興產品。研究金花白茶中金花菌的類型有利于為白茶產業的創新發展提供一定的參考依據。本研究以產自2018年的湖南湘豐牌桑植白茶作為材料，通過平板涂布法及三點接種法分離純化金花菌，采用形態學觀察并聯合分子生物學手段對所獲得的分離株進行鑒定。分離獲得一株金花菌BC-1，經菌落特征、顯微形態觀察、ITS測序及系統進化樹構建，將該菌鑒定為冠突曲霉（Aspergillus cristatum）。從白茶中分離獲得的金花菌BC-1為冠突曲霉（A. cristatum），豐富了白茶中金花菌的分類鑒定研究，對金花白茶的開發利用提供一定的參考。

關鍵詞：白茶;金花菌;冠突曲霉;冠突散囊菌;分離;鑒定

中圖分類號：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A

Isolation and Identification of Golden Flower Fungus

from White Tea

WU Feng，DENG Youzhan，QIN Yuyan，JIANG Yuehua，

ZHANG Lijuan，LUO Yican，LI Donggui

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Quality Supervision and Testing Center of Subtropical Fruit and Vegetable， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract： Golden flower white tea is a new production of white tea. To study the types of golden flower fungus in golden flower white tea is helpful to provide a theoretical basis for the innovative development of white tea industry. In this study， Hunan Xiangfeng Sangzhi white tea produced in 2018 was used as material， the golden flower fungus was isolated and purified by plate coating method and three-point inoculation method， and the obtained isolate was identified by morphological observation and molecular biological methods. A strain of golden flower fungus BC-1 was isolated and identified as Aspergillus cristatum by colony characteristics， microscopic morphology observation， ITS sequencing and phylogenetic tree construction. The study enriches the research on the classification and identification of golden flower fungus in white tea， and provides a certain reference for the development and utilization of golden flower white tea.

Key words： White tea; golden flower fungus; Aspergillus cristatum; Eurotium cristatum; isolation; identification

白茶屬于我國的六大茶葉類型之一，也是一種微發酵茶。傳統的白茶無需殺青或揉捻，只經過包括萎凋、干燥、揀剔等工序制作而成[1-3]。白茶的味道清淡甘甜，起到清熱潤肺、消炎解毒等多種保健作用[4]，因而深受廣大消費者的喜愛。

傳統的白茶沒有發花工藝，但隨著茶葉市場的大熱，市面上也出現了帶“金花”的白茶。金花白茶源于前人一次偶然下發現了白茶中的“金花”，經過該團隊多年研究，通過在白茶工藝上添加使用模擬茯磚茶自然發花過程研制形成金花白茶[5]。隨著2018年7月14日金花白茶創新研討會的成功舉辦以及金花白茶企業標準的第一次公開發布，金花白茶作為白茶的一個新型產品，有力推動了白茶產業的創新和升級。目前，國內外學者對白茶的研究主要集中在生產工藝、生理生化成分、感官品質以及保健功效等方面[4，6-9]。

茶葉中的微生物種類繁多，在某種程度上會對茶葉的原有品質和風味造成影響。茶葉在國內外市場的大熱，使得茶葉中的微生物成為了研究熱點之一，出現了大量以茯磚茶等黑茶為代表的金花菌分類鑒定的相關研究報道。根據前人研究報道，金花菌有多種不同的鑒定結果[10-20]，如冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、謝瓦散囊菌（E. chevalieri）、雪花散囊菌（E. niveoglaucum）、阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）等，最終命名至今尚存在異議，但多數文獻以“冠突散囊菌（E. cristatum）”進行報道，也是最為常見的金花菌類型。

大多數人對金花菌的研究主要關注于茯磚、六堡、普洱等黑茶品種上，而對白茶金花菌的研究鮮少報道。金花白茶中的“金花”是模擬茯磚茶發花工藝產生，作為決定金花白茶品質的關鍵要素之一，與茯磚茶等黑茶中產生的金花菌是否為同一類型，值得大家關注。本研究選用市售某品牌的金花白茶材料進行金花菌的分離鑒定，通過培養基分離純化金花白茶中的金花，觀察培養基上菌落生長情況及形態特征，運用ITS序列進行測序及構建系統進化樹，以期從分子水平上初步揭示金花白茶中金花菌的類型，為白茶中金花菌的分類鑒定和白茶的深入研究提供相應的理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗用茶葉樣品為市售的湖南湘豐牌桑植白茶，為2018年生產的白茶緊壓茶，凈含量為1000 g，茶樣見圖1。

用于金花菌菌株的分離純化的馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基和菌株形態鑒定用的察氏（CZ）培養基，均購于環凱微生物;用于DNA提取的植物基因組DNA提取試劑盒、用于PCR產物純化的通用型DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖等物品和試劑均購于天根生化，2×EasyTaq■PCR SuperMix （+dye ）、DNA Maker等購于北京全式金。

1.2 主要儀器設備

潔凈工作臺、霉菌培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、普通光學顯微鏡、普通PCR擴增儀、電泳儀、離心機、電動研磨儀、凝膠成像系統。

1.3 實驗方法

1.3.1 白茶樣品金花菌的分離純化

白茶茶樣中金花菌的分離按照GB 4789.15-2016國家標準中的方法一進行操作[21]，機械粉碎茶樣材料，在無菌條件下稱取粉碎的茶樣材料25 g，加入225 mL已滅菌的磷酸緩沖液，充分振搖混勻，按10倍遞增系列稀釋，吸取100 uL稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液，使用涂布棒均勻涂布在PDA培養基上，28℃培養5天，選取典型的黃色單菌落進行多次劃線分離純化直至獲得單一純化菌株[17]。

1.3.2 菌株的形態學觀察

將已純化的金花菌菌株按照三點接種法分別轉接至PDA和CZ培養基上，28℃培養5天，記錄不同培養基上的菌落形態特征;挑取CZ培養基中微量菌絲，觀察及拍照該菌株的典型顯微形態特征。

1.3.3 白茶金花菌的分子鑒定

1.3.3.1 菌株基因組DNA的提取

刮取少量新鮮培養的菌絲于已滅菌的試管，加入液氮后使用電動研磨儀迅速將菌絲研磨至粉末狀，之后按照天根植物基因組DNA提取試劑盒說明書上的實驗步驟提取DNA。

1.3.3.2 ITS序列的擴增及測序

采用真菌通用的ITS引物[22]對提取的菌株DNA進行PCR擴增，引物序列詳細信息如表1所示，由上海生工合成。PCR反應體系：DNA模板1.0 μL，2×EasyTaq PCR■SuperMix （+dye ）（全式金）12.5 μL，引物各0.5 μL，加無菌水補足至25.0 μL。電泳檢測PCR產物，凝膠成像系統拍照。之后使用天根通用型DNA純化回收試劑盒純化的PCR產物后送到上海生工測序。PCR反應條件和擴增程序設定如下：

預變性：94℃? ? ? 5 min

變性： 94℃? ? ? 30 s

退火： 58℃? ? ? 30 s ? ? ? ? ? ?35 cycle

延伸： 72℃? ? ? 30 s

終延伸：72℃? ? ? 10 min

保存： 4℃? ? ? ? 60 min

1.3.3.3 系統進化樹的構建

使用NCBI數據庫中的BLAST對測序所獲的ITS序列進行同源性比對，下載數據庫中相似度較高的同源序列，運用MEGA 7.0.14版本進行序列比對和系統進化樹的構建（Neighbor-joining方法，Bootstrap驗證，P-distance模式，隨機搜索設為1000）。

2 結果與分析

2.1 白茶金花菌的形態特征

將獲取的金花菌菌株編號BC-1。該菌株在PDA培養基上生長較慢，培養5天菌落直徑為22～25 mm（圖2-A、2-B），正面看整個菌落呈圓形，菌落質地致密，有放射性脊，顏色分層明顯類似于同心圓狀，邊緣為淺黃色輻射狀，中間部分顏色較深，從外到里呈淺黃色、深黃色至黑褐色，菌落黑褐色部分向外滲出黑色水滴狀液體;反面看菌落從外到里呈金黃色、深黃色、黑褐色，顏色逐步加深。該菌株在CZ培養基上生長較快，培養5天菌落直徑為26～30 mm（圖2-C，2-D），正面看整個菌落均呈金黃色蓬松絨狀，中間微隆起，有放射性脊;反面看菌落中間接種點呈黑褐色，由里向外從深黃色變成金黃色。刮取少量菌絲在顯微鏡下觀察，可看到大量近圓球狀的黃色閉囊殼（圖2-E），這些黃色閉囊殼中包裹了許多球狀子囊，破裂后會釋放出來，進而產生大量的子囊孢子（圖2-F）。

2.2 白茶金花菌的分子鑒定及系統進化樹構建

使用ITS通用引物對提取的BC-1金花菌株DNA進行PCR擴增，經電泳檢測顯示（圖3），所擴增的PCR產物條帶單一明亮，位于500～600 bp之間，與預期結果相符。將測序所獲ITS序列在NCBI上進行同源比對并構建系統進化樹（圖4），結果表明，白茶金花菌株BC-1的ITS序列（登錄號：OM250369.1）與NCBI數據庫中的Aspergillus cristatum（登錄號：MH496725.1、MG659640.1、MG659637.1、KX858811.1）相似度高達100%，而且菌株在系統進化樹上屬同一分支。以序列相似程度≥97%劃分為同一個操作分類單元（OTU）原則[23]作為參考依據，本研究從金花白茶中分離的菌株BC-1與Aspergillus cristatum為同種微生物，結合菌株BC-1的菌落及顯微形態特征，可將其鑒定為冠突曲霉（A. cristatum）。

3 討論

真菌的形態特征復雜，不同環境條件下某些真菌的形態特征和生殖方式可能會發生改變，因而單單采用形態學鑒別真菌容易影響結果的準確性。隨著DNA測序技術的快速發展，核酸序列分析被廣泛應用于微生物的分類鑒定中，其中ITS片段因其長度和序列變化較大，在真菌的分類鑒定中獲得普遍應用。本研究對市售的湖南湘豐牌桑植白茶中的分離純化獲得的金花菌菌株BC-1進行菌落及顯微形態特征鑒定，表明該菌具有金花菌的典型特征，ITS序列測序結果表明金花菌菌株BC-1與冠突曲霉（A. cristatum）高度相似，且在系統進化樹上屬于同一個分支，得出該金花白茶的金花菌株BC-1為冠突曲霉（A. cristatum）的結論。這與陳勇強[5]的“福鼎”白茶的研究結果相同。

金花菌存在有性型和無性型兩種繁殖方式，例如冠突曲霉（A. cristatum）為有性型，而冠突散囊菌（E. cristatum）為冠突曲霉（A. cristatum）的無性型。目前金花菌的鑒定和命名有較大爭議，比如鑒定是同一種菌應當以有性型還是無性型進行命名;其次是金花菌屬于哪一種。多數茶學研究者通過試驗研究表明了金花菌為冠突散囊菌（E. cristatum）[10-12]。呂嘉櫪等認為陜西茯磚茶中有謝瓦散囊菌（E. chevalieri）、冠突散囊菌（E. cristatum）、阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）、肋狀散囊菌（E. costiforme）4種優勢金花菌[14，15]。胡治遠等認為湖南產區茯磚茶樣品中優勢微生物主要有上述4中散囊菌還有蠟葉散囊菌（E. herbariorum）等散囊菌屬真菌[16];歐惠算、毛彥、陳然等人分別從不同的六堡茶樣品中分離得到阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）[17]、雪黃散囊菌（E. niveoglaucum）[18]、冠突散囊菌（E. cristatum）[19];鄧秀娟等通過illumina Miseq測序技術發現了普洱茶中存在雪黃散囊菌（E. niveoglaucum）[20]。上述學者們在茯磚茶、六堡茶、普洱茶等黑茶中發現了不同類型的金花菌，也說明黑茶中的金花菌具有多樣性。

金花白茶作為一種新興產品，金花數量成為了衡量金花白茶品質的重要指標之一。本研究通過對金花白茶中的金花菌進行分離鑒定，確定該金花白茶中的金花菌為冠突曲霉（冠突散囊菌的有性型），這與茯磚茶中的冠突散囊菌鑒定結果一致[10-12]，本研究結果為白茶中金花菌的分類鑒定和開發利用提供相應的理論依據，也為探討白茶中的微生物及其作用、促進白茶產業的發展提供一定的參考依據。

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