蓖麻種子萌發和幼苗生長對重金屬Cu2+的脅迫響應※

●梁嘯天 羅 蕊 趙志強 包春光 賈崇寧 霍玉淼 任文靜 袁樸芳 高 昶 黃鳳蘭,4,5,6,7,8※※

（1.內蒙古民族大學生命科學與食品學院 內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古民族大學農學院 內蒙古 通遼028000；3.通遼市農畜產品質量安全中心 內蒙古 通遼 028000；4.蓖麻育種國家民委重點實驗室 內蒙古 通遼 028000；5.內蒙古自治區高校蓖麻產業工程技術研究中心 內蒙古 通遼 028000；6.內蒙古自治區蓖麻育種重點實驗室 內蒙古 通遼 028000；7.內蒙古自治區蓖麻產業協同創新中心 內蒙古 通遼 028000；8.蓖麻產業技術創新內蒙古自治區工程研究中心 內蒙古 通遼 028000）

蓖麻（Ricinus communisL.）是世界上重要的非食用油料植物，含油率高達60%左右，被譽為“可再生的石油資源”[1]，因其具有特色經濟價值而廣受重視[2]。據報道，土壤被重金屬污染后，蓖麻仍可正常生長，表明蓖麻是一種對重金屬抗性較強的植物，具有修復重金屬污染土地的功能。有學者對銅礦區周圍生長的野生蓖麻進行研究，發現蓖麻不僅能夠在銅礦區正常生長，還能夠在植株內部富集Cu2+，表現出較強的重金屬抗性[3]。

近年來，土壤重金屬污染現象日益嚴重，主要重金屬污染物包括汞、鎘、鉛、銅、鉻、砷、鎳等[4]，對土壤危害較大，其無法被土壤中的微生物分解，導致更多的重金屬離子在土壤中累積而轉化為危害更大的化合物。部分重金屬會通過食物鏈進入人體，嚴重危害人類身體健康。研究發現，通過植物的吸收、根濾、穩定可以降低土壤重金屬污染程度，具有一定的土壤修復作用[5]。銅是植物生長發育必需的微量元素，參與植物體內多種氧化酶的組成及氧化還原反應，適量的銅能夠對植物生長起到促進作用，過量的銅則會導致植物葉片枯黃進而抑制其光合作用，甚至阻礙植物對其他元素的吸收[6]。

目前，眾多學者研究了水稻和小麥對Cu2+脅迫的耐受性，也有關于蓖麻對鎘脅迫以及鉛、鋅復合脅迫的耐受性研究，但未見關于蓖麻對Cu2+脅迫的耐受性研究[7-9]。因此本實驗選擇不同濃度CuSO4溶液對蓖麻進行處理，研究蓖麻種子萌發和幼苗生長對重金屬Cu2+的脅迫響應，以期驗證蓖麻作為特色經濟植物在應對重金屬污染土壤修復問題的應用可行性以及適用條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料本實驗所用的植物材料為2129 品系蓖麻種子，由內蒙古民族大學內蒙古自治區高校蓖麻產業工程技術研究中心提供。

1.1.2 試劑材料液氮、 愈創木酚、30%H2O2、五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）、20%三氯乙酸（TCA）、0.5%硫代巴比妥酸（TBA）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.8，50mM）、還原性輔酶II（NADPH）、谷胱甘肽（GSSG）。

1.1.3 其他材料蛭石、土。

1.2 儀器設備

萬用電爐（DL-1），電子天平（Satirius BSA224S-CW），高速大容量低溫離心機（Thermo MULTIFUGE X3R），小型高速低溫離心機（Eppendorf Centrifuge 5424 R），HVE-50 型高溫高壓滅菌鍋（日本），-80℃超低溫冷凍冰箱（Thermo Scientific Forma 702），酶標儀（Iinfinite M200 pro），電腦（Lenovo）。

1.3 實驗設計

選用飽滿度一致的蓖麻種子1 200 粒，共設置12 組培養方案，對照組使用清水，另外11 組處理組分別使用Cu2+濃度為120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320mg/L的CuSO4溶液，放在25 ℃有光照的溫室中培養72h[10]。

當蓖麻生長到四葉期時，選取植株高度、葉片大小一致的20 盆幼苗分別設置為10 個對照組和10 個處理組。對照組幼苗生長期間每次澆1 L 清水，處理組幼苗生長期間每次澆Cu2+濃度為840mg/L（當Cu2+濃 度 為840mg/L 時， 蓖 麻既不受嚴重抑制也不受促進生長，視其為臨界值）的CuSO4溶液1L。分別在7d、15d、21d 拍攝植株整體、葉及根的照片，對比處理組與對照組的區別[11]。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 測定指標不同處理組環境下測定蓖麻種子萌發率、根形態（根長、根粗）、種子生理指標[MDA（丙二醛）含量、POD（過氧化物酶）活性、CAT（過氧化氫酶）活性、GR（谷胱甘肽還原酶）活性]、幼苗生理指標(同種子生理指標)。

1.4.2 測定方法

1.4.2.1 種子萌發率統計不同處理組的種子萌發個數與未萌發個數，計算種子萌發率，公式：

1.4.2.2 根形態使用游標卡尺測量不同處理已萌發蓖麻種子的15 個根長數據與5 個根粗數據并記錄[13]。

1.4.2.3 蓖麻萌發種子生理指標通過對蓖麻種子萌發率的計算以及萌發種子根長根粗的測量，確定2129 品系蓖麻種子對重金屬Cu2+濃度的最大抗性值，按以下方法測定最大抗性濃度萌發種子的MDA 含量、POD 活性、CAT 活性、GR 活性。蓖麻萌發種子預處理。將不同處理下的萌發種子置于預冷的研缽中，倒入液氮研磨成干粉，以每份0.4g 分裝于15mL 離心管內，加入4mL 的PBS，用搖床搖10min，混成勻漿后在6℃、6 000 rpm下離心10min，留取上清液即獲得酶粗提液。將上清液每份1mL 分裝于1.5mL 離心管內，-80℃超低溫冰箱保存備用。

MDA 的測定方法。吸取1mL 上清液置于玻璃試管中并加入2mL 0.5% TBA 沸水浴15min，然后進行冰上冷卻，冷卻后吸取1mL 置于1.5mL 離心管內，10 000rpm 下離心10min。取200μL 上清液測定OD450、OD532、OD600。對照組以PBS 代替酶液調零。

MDA 濃度和含量的計算公式：

其中，V1為提取液總體積（4mL）；V2為測定用酶液體積（1mL）；W 為樣品鮮重（0.4g）[15]。

POD 的測定。取50mL PBS 置于燒杯中，加入28μL 愈創木酚攪拌，直至愈創木酚溶解，再加入19μL 30%的H2O2，混勻后置于水浴鍋中34℃加熱10min。避光保存于4℃冰箱中備用。取2mL 混合液并加入20μL 酶液，測定OD470值3min 內的變化。對照組以PBS 代替酶液調零。以每分鐘OD 值變化（升高）1 為1 個酶活性單位（U）。按下式計算活性：

其中，ΔOD470為反應時間內吸光度的變化；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應時間（3min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V2為測定時取用酶液體積（0.02mL）[16]。

CAT 的測定。4mL 離心管中各加入1.5mL 的PBS、1mL 蒸餾水，置于水浴鍋中25℃預熱5min，向每個離心管中加入0.3mL H2O2（0.1mol/L），混勻后備用。每管再加入200μL 酶液，測定OD240值3min 內的變化。對照組以PBS 代替酶液調零。以每分鐘OD值變化（減?。?.1 為1 個酶活性單位（U）。按下式計算活性：

其中，ΔOD240為反應時間內吸光度的變化；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應時間（3min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V2為測定時取用酶液體積（0.2mL）[17]。

GR 的測定。4mL 離心管中各加入1 550μL 的PBS、140μL 的NADPH，260μL 的GSSG，混 勻后備用。每個離心管中加入300μL 酶液，測定OD340值2min 內的變化。對照組以PBS 代替酶液調零。

在一定溫度下，每克樣本每分鐘催化1μmol NADPH 氧化為1 個酶活單位（U）。按下式計算活性：其中，ΔOD340為處理組反應時間內吸光度的變化；ΔOD對照為對照組反應時間內吸光度的變化；ε為NADPH 摩爾消光系數6.22×103L·mol/cm；d為比色皿內徑（5.85mm）；W為樣品鮮重（0.4g）；t為反應時間（2min）；V1為提取酶液總體積（4mL）；V3為反應體系總體積（2.25mL）；V2為測定時取用酶液體積（0.3mL）[18]。

1.4.2.4 蓖麻幼苗生長指標測定測定處理組與對照組蓖麻幼苗的MDA 含量、POD 活性、CAT活性、GR 活性四項生理指標。測定方法同種子生理指標測定方法[15-18]。

2 結果與分析

2.1 蓖麻種子萌發對重金屬Cu2+的脅迫響應

2.1.1 蓖麻種子萌發率使用濃度為0mg/L、120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320 mg/L 的CuSO4溶液分別處理蓖麻種子。蓖麻種子萌發率比較結果，見表1。

表1 種子萌發率比較結果

由表1 可知，雖然組間顯著性差異明顯，但Cu2+濃度的高低對2129 品系蓖麻種子的萌發率無明顯影響規律。

2.1.2 蓖麻萌發種子根的形態學圖1 為使用清水組與Cu2+濃度為840mg/L 的CuSO4溶液處理后的蓖麻種子萌發狀況，圖2 為萌發種子根長測量結果，圖3 為萌發種子根粗測量結果。

由圖1、圖2 可知，蓖麻種子的根長對Cu2+低濃度與高濃度存在不同的脅迫響應。Cu2+濃度低時，可以促進蓖麻種子根的生長；Cu2+濃度高時，可以抑制蓖麻種子根的生長。由圖1、圖3可以看出，蓖麻種子根粗的生長受Cu2+的脅迫效應不明顯。

2.1.3 蓖麻萌發種子的生理指標使用濃度為0mg/L、840mg/L 的CuSO4溶液分別處理蓖麻種子后，處理組與對照組各項生理指標測定結果，見圖4。

由圖4 可以看出，用Cu2+濃度為840mg/L 處理的蓖麻種子萌發后，處理組MDA 含量和CAT活性明顯高于對照組，但POD 活性和GR 活性明顯低于對照組。

2.2 蓖麻幼苗生長對重金屬Cu2+的脅迫響應

2.2.1 蓖麻幼苗形態學統計清水對照組與Cu2+濃度為840mg/L 處理組各10 盆（每盆1 株），當蓖麻幼苗長到四葉期的時候分別使用Cu2+濃度為840mg/L 的CuSO4 溶液及清水對兩組幼苗進行澆灌。圖5、圖6、圖7 分別為處理7d、15d、21d后的蓖麻幼苗生長狀況。其中，A 為植株對比照片，左為處理，右為對照（CK）；B 為葉片對比照片，左為處理，右為對照（CK）；C 為根部對比照片，左為處理，右為對照（CK）。

由圖5、圖6、圖7 可以看出，隨著處理時間的增加，處理組蓖麻植株高度逐漸矮于對照組，處理組根量明顯少于對照組，處理組葉脈褪綠逐漸加深。

2.2.2 蓖麻幼苗四葉期葉片生理指標清水對照組與Cu2+濃度為840mg/L 處理組各10 盆（每盆1株），當蓖麻幼苗長到四葉期的時候，使用濃度為840mg/L 的CuSO 溶液及清水對兩組幼苗進行澆灌。圖8 為蓖麻葉片的生理指標測定結果。

由圖8 可知，當使用Cu2+濃度為840mg/L的 CuSO4溶液澆灌蓖麻21d 后，隨著處理時間的增加，對照組MDA 含量同處理組相比，對照組MDA 含量在7d 至15d 升高，在15d 至21d 下降；處理組MDA 含量在7d 至15d 升高，在15d至21d 降低，但變化趨勢不如對照組明顯。對照組POD 活性同處理組相比，其變化趨勢大致相同，對照組與處理組P OD 活性在7d 至15d內大幅度降低，在15d 至21d 略微升高，但處理組POD 活性升高趨勢較對照組明顯。對照組CAT 活性同處理組相比，對照組CAT 活性在7d 至15d 內明顯降低，在15d 至21d 明 顯升高；處理組CAT 活性在7d 至15d 內明顯升高，在15d 至21d 略微降低。對照組GR 活性同處理組相比，其變化趨勢有明顯不同，對照組GR 活性在7d 至15d 明顯降低，在15d 至21d 明 顯升高；處理組GR 活性在7d 至15d 內明顯升高，在15d 至21d 明顯降低。蓖麻種子在Cu2+濃度為1 320mg/L 時仍未死亡，表明蓖麻種子對Cu2+具有很強的耐受性；蓖麻幼苗在Cu2+濃度為840mg/L 時處理至21d 仍未死亡，證明蓖麻幼苗對Cu2+也有很強的耐受性。

3 結果與分析

3.1 重金屬Cu2+對蓖麻種子萌發的影響

蓖麻種子萌發的過程需要大量的物質與能量，儲存在種子中的有機物在種子萌發時會轉化成容易被胚吸收的形態，從而為種子萌發提供能量[19]，在其萌發階段，受外界因素影響較大，當使用重金屬Cu2+對其進行脅迫時，蓖麻種子的萌發受到影響，Cu2+通過抑制蓖麻種子內酶的活性，從而抑制蓖麻種子內有機物的轉化，使蓖麻種子萌發受到抑制。此次種子萌發率實驗在設計時未考慮到三次重復，因此在經過Cu2+濃度為840mg/L的CuSO4溶液處理蓖麻種子后，雖然在組間表現出差異性顯著卻未能表現出重金屬Cu2+對蓖麻種子萌發率的影響規律，但在測量其根長時卻發現不同Cu2+濃度處理組萌發種子的根長與對照組相比有明顯不同，根據蓖麻萌發的形態學特征和生理指標變化可以判斷重金屬Cu2+的脅迫可能有：抑制種子內酶的合成，從而抑制種子內有機物的轉化。POD 活性、GR 活性顯著性減少，可能是重金屬Cu2+抑制種子細胞內的過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性，進而抑制了種子萌發后根的生長。通過查閱文獻可知，水稻在Cu2+濃度為6.4mg/L 進行種子萌發處理時會出現種子死亡現象，小麥在Cu2+濃度為32mg/L 進行種子萌發處理時會出現種子死亡現象[20]。通過蓖麻與水稻種子、小麥種子對比，可以看出蓖麻對Cu2+脅迫具有很強的耐受性。

3.2 重金屬Cu2+對蓖麻幼苗生長的影響

蓖麻生長過程中會通過葉片進行光合作用，而根系吸收養分為蓖麻生長提供必需能量，因此，蓖麻產量會受其幼苗的生長狀態影響[21]。根據蓖麻幼苗的形態學特征和生理指標變化可以判斷Cu2+的脅迫可能有：重金屬Cu2+污染土壤后，蓖麻根部開始吸附Cu2+并在體內運輸，從而導致植株代謝過程紊亂，葉片內葉綠素減少或失去活性，葉脈失綠，光合作用受到影響[22]，其根系吸收營養物質的能力也會有所下降，造成幼苗生長期營養不良。蓖麻幼苗期是受重金屬Cu2+脅迫的最顯著時期[23]，處理組CAT 活性和GR 活性與對照組相比顯著性增加，表明蓖麻的抗逆性增強。Cu2+對蓖麻幼苗生長的脅迫原理可能與脅迫種子的原理相同，通過抑制植株過氧化物酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽還原酶的合成，從而抑制植株有機物的轉化[24]。因本次盆栽實驗中重金屬Cu2+濃度雖達到840mg/L 卻未出現植株死亡現象，故認為2129 品系蓖麻是有重金屬抗性并具有一定重金屬積累作用的特色經濟作物[25]。通過查閱文獻可知，水稻幼苗對Cu2+耐受最大濃度為10mg/L，Cu2+濃度越高，對水稻幼苗生長的抑制作用越大[26]；小麥幼苗對Cu2+耐受最大濃度為100mg/L，Cu2+濃度越高，對小麥幼苗生長的抑制作用越大[27]。通過蓖麻與水稻、小麥幼苗相比，可以看出蓖麻對Cu2+脅迫具有很強的耐受性。

4 結論

蓖麻種子和幼苗對Cu2+的脅迫響應，實驗結果如下：種子萌發階段，萌發率在組間雖表現出明顯差異但未表現出明顯脅迫規律；根長隨Cu2+濃度的增加整體呈現下降的趨勢；根粗隨濃度的增加無顯著變化，但使用Cu2+濃度為840mg/L 的CuSO4溶液對蓖麻種子進行萌發處理時，蓖麻種子對Cu2+表現出最大抗性；Cu2+濃度為840mg/L時，蓖麻萌發根長度最接近平均值，對其進行四項生理指標測定，發現處理組種子MDA 含量和CAT 活性明顯高于對照組，但POD 活性和GR 活性明顯低于對照組。幼苗生長階段，用Cu2+濃度為840mg/L 的CuSO4溶液處理后，隨處理時間的增加，處理組植株高度逐漸矮于對照組；處理組葉片與對照組相比葉脈明顯褪綠；處理組根量明顯少于對照組；生理指標方面，處理組和對照組MDA 含量、POD 活性的變化趨勢相同，CAT 活性、GR 活性變化趨勢相反，MDA 含量、CAT 活性以及GR 活性升至最大值，POD 活性降至最小值。由此可得出結論，蓖麻主要發揮其超累積優勢，對重金屬實現強有效的解毒及累積，所以蓖麻完全可以為修復重金屬污染及環境治理發揮特殊優勢。