鹿腦小分子活性肽對D-半乳糖所致衰老模型小鼠的保護作用※

●陳克成 魏 宇 丁云錄 陳浩誠 李慶杰※※ 劉 爽

（1.吉林金梓源生物科技有限公司 吉林 四平 136000；2.吉林農業大學中藥材學院 吉林 長春 130118；3.長春中醫藥大學附屬醫院 吉林 長春 130021；4.澳大利亞三葉草健康研究院 澳大利亞 悉尼 NSW 2000）

衰老伴隨著記憶力下降、免疫力低下、細胞凋亡、氧化物水平升高以及腦、胸腺、脾臟、肝、腎等組織器官的退化及病變。衰老是不可避免的，但減慢衰老的速度是可行的，因此找到具有確切效果且作用機制明確的抗衰老藥物是非常重要的。梅花鹿作為重要的藥用動物資源已經被廣泛研發和應用，藥用及保健價值巨大，但鹿腦除了古人應用并記載其具有補骨髓、補虛勞、益腦等作用外，尚未在現代醫藥行業中見到對其研究和應用，為更好地利用鹿腦，本文對鹿腦小分子活性多肽進行了初步研究。

鹿腦小分子活性多肽是以梅花鹿鹿腦為原料，經酶解、提取、分離、純化獲得的分子量范圍在1~6KDa 之間的小分子活性多肽。本研究采用D-半乳糖所致衰老小鼠模型，觀察鹿腦小分子活性肽對衰老小鼠的學習記憶行為、重要臟器的形態和病理變化、腦組織BDNF、NGF 含量和腦組織BDNF 蛋白表達的影響，為進一步開發鹿腦小分子活性肽的抗衰老藥用價值、延緩腦衰老提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物選擇SPF 級ICR 小鼠，雌雄各半，體重均在18~22g 之間。動物合格證號：SCXK-（吉）2018-0007，購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。飼養環境，室溫21～23℃，相對濕度40%～60%，室內12h 明暗自動切換，通風良好。動物購買回來后，分別放入籠中飼養，自由進食、喝水。

1.1.2 藥品及試劑鹿腦小分子活性肽，性狀：淺黃色粉末，批號：20191201，由長春中醫藥大學附屬醫院中醫藥研究中心提供。吡拉西坦片，規格：400mg/片，批號：190821，浙江愛諾生物藥業股份有限公司產品。D-半乳糖（D-gal），規格：100g/瓶，批號：1AN10203，上海源葉生物科技有限公司產品。神經營養因子（BDNF）試劑盒，規格：96T/盒，批號：E20190901A；神經生長因子（NGF）試劑盒，規格：96T/盒，批號：E20190901A，均購自美國RD 公司。組織固定液，規格：5 000mL/瓶，批號：18121204，廣州維格斯生物科技有限公司產品。

1.1.3 儀器及器材酶標儀，型號：BIO680，Japan BIO RAD 公司產品；Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統，型號：DB001，北京智鼠多寶科技有限公司產品；圖像分析系統，型號：NIS-ELEMNT BR，日本NIKON 公司產品；光學顯微鏡，型號：OlympusBX51，日本Olympus 公司產品；臺式高速低溫離心機，型號：Allegra X-64R，美國貝克曼公司產品；電熱恒溫水浴鍋，型號：BHS-6，上海凌科實業有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組選用SPF 級ICR 小鼠，雌雄各半，共60 只。將用普通飼料進行喂養7d 后的小鼠，隨機分配給正常對照組、模型對照組、陽性對照藥吡拉西坦（300mg/（kg·d））劑量組、鹿腦肽小分子活性組高劑量組（100mg/（kg·d））、中劑量組（50mg/（kg·d））和低劑量組（25mg/（kg·d））共6 組，10 只/組[1-2]。

1.2.2 造模及給藥建立小鼠衰老動物模型，分為模型對照組、陽性對照組和鹿腦小分子活性肽3 個劑量組，分別皮下注射D-半乳糖150mg/kg，正常對照組皮下注射等體積生理鹽水，每日注射給藥1 次，連續6 周。實驗期間自由攝食飲水，節律光照。在造模的同時灌注供試藥品混懸液，正常對照組及模型對照組灌注蒸餾水。每天進行1 次灌胃，持續6 周。每隔一天稱量一次各組小鼠體重，并調節給藥劑量[3]。

1.2.3 Morris 水迷宮實驗給藥結束后第2 天進行Morris 水迷宮實驗，檢測小鼠的空間學習記憶能力。實驗時水的深度為20cm，溫度（25±1）℃，將小鼠從第二象限標記處逐個放置在水池中，并使小鼠面對墻壁，自動錄像系統記錄了小鼠從下水到爬上平臺的時間（以四肢爬上平臺為準），這就是逃避潛伏期。如果小鼠在2min 內不能到達平臺，就要將小鼠引導至平臺，時間記為2min。當小鼠爬上平臺休息10s 后，進行其他小鼠的測試，每只小鼠每天1 次，共4d。第5 天，撤除平臺，面向池壁將小鼠放入水池中，以小鼠首次通過平臺的時間和2min 內通過原平臺的次數來評價小鼠的學習記憶能力[4]。

1.2.4 取材及檢測行為學實驗結束，1%戊巴比妥0.5～1.0mL 腹腔麻醉，解剖取腦，稱量全腦重量，按公式計算腦指數；剪取一部分腦組織，用組織固定液固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，做病理組織學檢查；采用免疫組化SABC 法觀察切片BDNF 的水平。另稱切取腦組織100mg，冷生理鹽水沖洗，加入冷生理鹽水進行勻漿，將得到的勻漿液在0～4℃溫度下以3 500r/min 的轉速進行離心，15min 后將所得上清液按說明書方法操作，通過ELISA 試劑盒對BDNF、NGF 含量進行測定[5]。解剖胸腺和脾臟，去除表面脂肪膜，用冷鹽水沖洗組織表面上的殘留血液，用濾紙吸干，稱重后計算內臟指數。計算公式：

臟器指數=臟器質量（mg）/體質量（g）

1.3 統計學處理

2 結果與分析

2.1 鹿腦小分子活性肽對D-半乳糖所致衰老模型小鼠學習記憶能力的影響

結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠明顯增加了逃避潛伏期、減少了穿臺次數（P<0.01）。鹿腦小分子活性肽劑量為100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 劑量組時，與模型組相比，逃避潛伏期縮短，穿臺次數顯著增加（P<0.01 或P<0.05）。結果見表1。

表1 鹿腦小分子活性肽對D-半乳糖所致衰老模型小鼠逃避潛伏期及穿臺次數的影響

2.2 鹿腦小分子活性肽對D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦、胸腺和脾臟指數的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦、胸腺和脾臟指數均顯著下降（P<0.01），這表明D-半乳糖所致衰老小鼠的腦和其他免疫器官等在逐漸發生萎縮。鹿腦小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 三個劑量組小鼠胸腺指數均有不同程度增加，與模型對照組比較，有顯著性差異（P<0.01 或P<0.05）；鹿腦小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 兩個劑量組中小鼠腦指數、脾臟指數均有一定程度的增長，與模型對照組比較，表現出顯著性差異（P<0.01 或P<0.05）。說明鹿腦小分子活性肽能表現出不同程度的抗腦萎縮和抑制衰老模型小鼠胸腺和脾臟的退化作用，增強小鼠免疫功能。結果見表2。

表2 鹿腦小分子活性肽對D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦、胸腺和脾臟指數的影響

2.3 鹿腦小分子活性肽對D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦組織中BDNF、NGF 含量的影響

在本實驗中，與正常對照組比較，模型組中小鼠腦組織中BDNF、NGF 含量顯著減少（P<0.01）。鹿腦小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg兩個劑量組小鼠腦組織中BDNF、NGF 含量顯著增加，與模型組大鼠比較差異顯著（分別為P<0.01 或P<0.05）；鹿腦小分子活性肽25mg/kg劑量組小鼠腦組織中BDNF 含量，與模型組大鼠比較，具有顯著性差異（P<0.05）。結果見表3。

2.4 鹿腦小分子活性肽對D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦組織中BDNF 蛋白表達的影響

本實驗中，模型對照組與正常對照組比較，小鼠腦組織中BDNF 蛋白表達明顯降低，具有顯著性差異（為P＜0.01）。鹿腦小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 三個劑量組與模型對照組比較，小鼠腦組織中BDNF 蛋白表達明顯升高，具有統計學意義（P＜0.01 或P＜0.05）。結果見表3。

表3 鹿腦小分子活性肽對D-半乳糖所致衰老模型小鼠腦組織中BDNF、NGF 含量及BDNF 蛋白表達的影響

2.5 衰老小鼠腦組織HE 染色組織病理學變化

圖1-6 結果顯示，正常對照組，小鼠腦組織的細胞膜連續、完整，海馬區神經元細胞結構、形態、大小正常，細胞排列緊密有序，胞質充盈，能清晰地看到細胞核、核仁和胞漿。模型對照組，小鼠腦組織出現部分深染的現象，細胞變小，細胞核呈固縮、破碎狀；海馬神經元細胞數量較少，排列紊亂、疏松， 形態不規則， 胞核模糊、固縮和胞漿減少，細胞不再充盈、結構變得模糊不清，表明有部分腦細胞發生壞死。與模型組比較，吡拉西坦組、鹿腦小分子活性肽高、中、低劑量組均可明顯改善上述病理改變，細胞壞死較輕，細胞結構、形態完整，且細胞的邊緣清晰，染色質較為均勻，其中鹿腦小分子活性肽高劑量組減輕腦細胞壞死的作用最為顯著，中、低劑量組作用與高劑量組比較略弱。

3 討論

衰老是整個人體形態結構和生理功能全面下降的復雜動態過程，與中樞神經系統退行性疾病的發生密切相關，防治衰老所致的神經系統退行性疾病、延緩腦衰已成為當今衰老生物學領域的重點研究課題[6-11]。以鹿腦小分子活性肽為研究對象，通過制備衰老小鼠模型，探討了鹿腦小分子活性肽抗衰老作用、對神經系統保護作用及其作用機制。

D-半乳糖誘導的衰老模型是國內外比較公認的動物衰老模型，成模動物顯示的各種老化現象與自然衰老相似，現已被廣泛用于抗衰老藥物的篩選和衰老的機理研究中[12-18]。而學習過程中所體現出來的記憶能力是評價腦衰老重要指標中的一個[19-21]。在這項研究中，采用水迷宮實驗，測定小鼠學習和記憶能力，發現與正常對照組相比，模型對照組小鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越原始平臺位置次數明顯減少，提示模型組小鼠已有腦衰老的行為學表現。與模型對照組相比，鹿腦小分子活性肽各給藥組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越原始平臺位置次數明顯增加。實驗結果表明，鹿腦小分子活性肽能夠干預衰老進程，可以顯著拮抗D-半乳糖對小鼠學習記憶功能的損傷。

臟器及腺體指數的變化可以初步衡量機體衰老程度。脾臟為體內最大的外周免疫器官，主要功能是為各種成熟的淋巴細胞提供免疫應答場所；胸腺是免疫調節的中心器官，對免疫應答和細胞免疫功能的發生有重要作用；胸腺、脾臟和腦重量均會隨著機體的老齡化進程而變輕，是反映動物在衰老變化過程中的主要指標，因此，腦、胸腺和脾臟指數的降低可間接反應機體的衰老程度。本次實驗研究可以得出，鹿腦小分子活性肽具有延緩小鼠臟器退化、提高免疫力及促進新陳代謝的作用，能有效增強衰老小鼠的體質，減緩小鼠腦萎縮及臟器功能的下降。

腦源性神經營養因子（Brain derived neurotrophic factor， BDNF）是在大腦中合成的蛋白質，它在中樞神經系統中的分布也十分廣泛，在中樞神經系統不斷地發育進程中，能夠對神經元的存活狀態、分化情況、生長發育中都具有至關重要的作用。研究發現，在神經系統疾病的發病過程和治療中也有BDNF 的參與，cAMP/PKA/CREB/BDNF 信號轉導通路與許多神經系統疾病引起的認知功能障礙有關[22-27]。本實驗結果提示，鹿腦小分子活性肽可以逆轉D-半乳糖所引起的cAMP/PKA/CREB 抑制作用，在細胞水平可以明顯提高D-半乳糖所致的BDNF 分泌降低作用，這也提示了鹿腦小分子活性肽在衰老動物模型中抗衰老作用可能是通過提高cAMP/PKA/CREB/通路的活性，促進腦內神經元BDNF 的表達和分泌，防止受損神經元的死亡，改變神經元的一系列病理狀態，促進受損神經元的再生和分化，并在成熟的中樞和周圍神經系統中維持神經元的存活和正常的生理功能。

本研究發現，經鹿腦小分子活性肽干預后，衰老小鼠在水迷宮實驗中空間認知功能得到改善，學習記憶功能得到提高；可以減緩小鼠腦萎縮及胸腺、脾臟功能的下降，可以明顯提高D-半乳糖所致腦組織中降低的NFG、BDNF 水平；能抑制腦組織病變，減少腦細胞凋亡，從而維持細胞和組織的正常功能，達到保持機體健康和延緩衰老的作用。本實驗結果也提示，鹿腦小分子活性肽可能具有改善腦血流，營養腦神經細胞，使受損神經細胞（或休眠的神經細胞）得到修復或激活作用，它可能對促進缺血區域側支循環的建立起積極作用。