不同培養和貯藏條件對‘鳳丹白’牡丹花粉萌發的影響

張 慶，陳一凡，趙鵬飛，宋子怡，張鈺鈺，張 芹

(河北農業大學園林與旅游學院，河北 保定，071000)

‘鳳丹白’是楊山牡丹(Paeoniaostii)較為常見的栽培品種，它主要的觀賞價值在于花色純白、花頭直立，然而由于其花色較單調較少在園林觀賞中應用，而多注重其藥用價值[1]?！P丹白’是目前油用牡丹的主要品種，其結籽量大、出油率高、生長勢強[2]，具有很好的適應性[3]，其籽油中含豐富的不飽和脂肪酸等，具有較高的營養價值[4]?；ǚ墼缙诓杉?、貯藏、生活力的測定是進行人工輔助授粉或雜交授粉的基礎[5]。本試驗采用離體萌發測定法，用液體培養基培養‘鳳丹白’花粉，而后在光學顯微鏡下觀察花粉萌發狀況[6]。根據蔡祖國等[7]的方法，進行適當調整后，再根據秦瑤等[1]的研究結果，將花粉離體培養8 h，對比不同質量濃度的蔗糖和硼酸組合溶液與花粉萌發的關系，進一步篩選得到最佳培養基后，進行相關的花粉萌發試驗，探究最佳的貯藏條件，進一步了解‘鳳丹白’牡丹花粉的生活力，為‘鳳丹白’牡丹的育種工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年4月中下旬進行，材料采自河北農業大學試驗苗圃內‘鳳丹白’牡丹。開花期早 8:00～9:00采集花粉，在無風天氣下，用鑷子輕采花藥，放在制版轉印紙紙袋中帶回實驗室。將采集下來的花藥放在硫酸紙上，室溫下自然陰干24 h，待花藥開裂、花粉自然散出后去除雜質收集，將收集好的花粉放在5 mL離心管中密封，4 ℃條件下貯藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1不同質量濃度蔗糖下花粉萌發情況將花粉用不同質量濃度的蔗糖(30，50，80，100，150 g·L-1)溶液培養8 h，觀察萌發情況，每個處理3次重復，每個重復隨機取3個視野進行觀察，每個視野統計花粉100粒以上，記錄數據，以清水為空白對照，統計萌發率，萌發標準為花粉管的長度≥花粉粒直徑的2倍，下同。

萌發率=(萌發的花粉數/花粉總數)×100%

1.2.2不同質量濃度硼酸下花粉萌發情況將花粉用不同質量濃度的硼酸(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1)溶液培養8 h，觀察萌發情況。

1.2.3不同質量濃度的蔗糖和硼酸組合溶液對花粉萌發的影響根據律春艷等[8]和蔡祖國等[7]研究所選的培養基質量濃度作為參考，進行適當調整。采用液體培養法，用添加不同質量濃度的硼酸(0.04，0.06，0.08 g·L-1)和蔗糖(60，80，100，120 g·L-1)的液體培養基培養8 h，觀察花粉萌發情況。

1.2.4不同培養時間對花粉萌發的影響篩選出最佳培養基后，在(25±1)℃恒溫箱中培養花粉，每隔1 h觀察1次萌發情況，連續觀察12 h，以確定花粉離體培養的最佳時間。

1.2.5不同溫度貯藏條件下干花粉萌發率的變化趨勢將收集備用的‘鳳丹白’花粉分別在30，25，4，-18，-80 ℃條件下貯藏0，1，3，5，7，9，12 d后，取出，用最佳培養基培養8 h后，觀察花粉萌發情況。

1.2.6濕花粉在25，30 ℃條件下萌發率的變化趨勢 將剛采下的新鮮狀態下的‘鳳丹白’花朵直接帶回實驗室，用鑷子摘下花藥，分別在25，30 ℃條件下貯藏0，1，2，3，5，7 h，觀察花粉活力變化。

1.3 數據統計與處理

數據分析采用Excel 2010和SPSS 16.0軟件進行數據處理及做圖。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度蔗糖下花粉萌發情況

隨著蔗糖質量濃度的增加，花粉萌發率呈現先升高后下降的趨勢(圖1)，在清水對照中花粉萌發率僅為6.04%，當蔗糖質量濃度在0～100 g·L-1時，花粉萌發率隨著質量濃度的增加而不斷提高，在蔗糖質量濃度為100 g·L-1時萌發率達到最大值(51.69%)，比對照提高了45.65個百分點，極顯著高于對照及其他處理。

2.2 不同質量濃度硼酸下花粉萌發情況

隨著硼酸質量濃度的提高，花粉萌發率先升后降(圖2)。當硼酸質量濃度在0～0.06 g·L-1時，花粉萌發率隨著質量濃度的增加而不斷提高，當硼酸質量濃度為0.06 g·L-1時萌發率達到峰值(36.71%)，比對照提高了30.99個百分點，極顯著高于對照及其他處理。質量濃度為0.04，0.08 g·L-1的處理之間差異不顯著。當硼酸質量濃度在0.06～0.10 g·L-1時，花粉萌發率隨著質量濃度的增加而不斷下降，在質量濃度為0.10 g·L-1時花粉萌發率僅有13.67%。

圖1 不同蔗糖質量濃度下花粉萌發情況 圖2 不同硼酸質量濃度下花粉萌發情況

2.3 不同質量濃度的硼酸和蔗糖組合溶液對花粉萌發的影響

將花粉置于不同質量濃度組合的液體培養基進行離體萌發培養，不同質量濃度的硼酸和蔗糖對花粉萌發率有顯著影響(表1)。用0.04 g·L-1硼酸+60 g·L-1蔗糖培養基培養花粉，萌發率只有40.42%。在硼酸質量濃度為0.06 g·L-1及蔗糖質量濃度為100 g·L-1時，花粉萌發率達到最高值，為63.22%，是最適的花粉離體培養質量濃度。而繼續加大硼酸和蔗糖的質量濃度，促進作用減弱，花粉萌發率呈現下降趨勢，當硼酸質量濃度為0.08 g·L-1及蔗糖質量濃度為120 g·L-1時，花粉萌發率降低到40.40%。當硼酸質量濃度固定不變時，加入蔗糖，花粉萌發率出現先升高后下降的趨勢；當蔗糖質量濃度固定不變時，加入硼酸，花粉萌發率出現先升高后下降的趨勢。本試驗結果表明：0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖是花粉離體培養的最佳培養基，對花粉萌發有著明顯的促進作用，花粉萌發率為63.22%。

表1 不同濃度的硼酸和蔗糖組合溶液對花粉萌發的影響

圖3 不同培養時間對花粉萌發的影響

2.4 不同培養時間對花粉萌發的影響

在0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖，溫度為(25±1)℃條件下，離體培養1 h萌發率較低，在花粉培養 1 h后花粉管長度達到標準，萌發率有所增加，約在2 h左右花粉萌發達到第1個小高峰，萌發率由0增長到12.57%；在2～4 h萌發率基本保持不變，大約在15.88%；在4～6 h花粉萌發進入第1個快速增長階段，在6 h的時候花粉萌發率由15.88%增長到41.94%，在6～8 h花粉進入第2個快速萌發階段，并在8 h時達到第2個高峰，此時花粉萌發率高達62.86%；在8～12 h時萌發率趨于穩定，基本保持在63%，觀察到花粉已基本完全萌發，所以花粉離體培養最適的鏡檢和統計時間為8 h(圖3)。

2.5 不同貯藏條件下干花粉萌發率的變化趨勢

在30，25，4，-18 ℃貯藏條件下，隨著貯藏時間的不斷延長，花粉內有機物質的不斷消耗，花粉的萌發率呈現下降的趨勢，但各貯藏條件下花粉萌發率的下降速度不一樣，在30 ℃貯藏條件下下降最快，花粉萌發率在前3 d下降的最快，由62.59%下降至28.66%，在第12 d時已經下降為0；25 ℃條件下次之，花粉萌發率在前3 d保持在50%以上，7 d時為40.82%，此時花粉仍具有較高的活力，在第12 d時為29.87%，與新鮮狀態下的花粉萌發率相比下降了32.72個百分點；4 ℃條件下下降速度減緩，花粉萌發率在第12 d時為59.70%，與新鮮狀態下的花粉萌發率相比下降了2.89個百分點；-18 ℃條件下花粉萌發率的變化不太明顯，第12 d的萌發率與新鮮狀態下的花粉萌發率相比僅下降了1.70個百分點。而在-80 ℃條件下花粉萌發率保持穩定不變，第12 d與第1 d花粉的萌發率無顯著差異(表2)。

表2 不同貯藏條件下的花粉萌發率 %

圖4 濕花粉在25，30 ℃條件下的萌發率

2.6 濕花粉在25，30 ℃條件下萌發率變化的趨勢

濕花粉在25，30 ℃條件下會隨著時間的推移花粉萌發率不斷下降，在30 ℃條件下7 h內由60.45%下降到50.58%，下降了9.87個百分點，在25 ℃條件下7 h內由60.45%下降到54.95%，下降了5.5個百分點(圖4)。

3 結論與討論

本次研究試驗了不同培養和貯藏條件對‘鳳丹白’牡丹花粉萌發的影響，用離體萌發的方式檢驗花粉活力。結果表明：(1)‘鳳丹白’牡丹花粉的萌發率，隨著培養液中蔗糖和硼酸質量濃度的升高呈先上升后下降的變化趨勢，0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖為最佳的培養基，離體培養8 h，花粉萌發率為63.22%。(2)‘鳳丹白’牡丹花粉生活力在低溫和超低溫條件下能夠長時間的保持，因此，低溫條件可作為長期保存花粉的手段。(3)濕花粉含水量高，在高溫條件下較干花粉更易失活，因此在保存花粉時，最好對花粉進行干燥處理，緩慢去除水分，如置于室內自然陰干或利用干燥劑去除花粉內多余的水分，并在低溫條件下貯藏，以保持較高的花粉生活力?；ǚ勖劝l率會因環境條件的改變而發生變化，在液體培養基中添加適宜質量濃度的蔗糖和硼酸可以提高花粉萌發率。蔗糖一方面為花粉萌發提供營養物質，另一方面能夠平衡花粉與培養液之間的滲透勢。適宜的蔗糖質量濃度對花粉萌發生長和花粉管伸長起著促進作用，質量濃度過低，花粉壁會破裂，內容物散出；質量濃度過高，則會造成花粉質壁分離，抑制花粉萌發生長[9]。適宜的硼酸質量濃度對花粉的萌發和花粉管的伸長有一定的促進作用[10]。崔曉龍等[11]認為，硼與糖結合后能極大地提高花粉萌發率。楊曉冬等[12]認為，硼離子能夠促進糖在植物組織中的運輸和代謝，而且硼離子對促進花粉管壁的形成也有一定的作用。董兆磊等[13]認為，在牡丹花粉萌發過程中硼酸起著顯著的促進作用，但當蔗糖質量濃度過低不能滿足花粉萌發的營養物質需求時，硼酸對促進牡丹花粉萌發作用不顯著，在蔗糖質量濃度偏高的情況下，加入硼酸會在一定程度上抑制花粉的萌發，硼酸質量濃度過高或不加硼酸會導致花粉萌發率低，萌發速度慢，花粉管長度短以及花粉管形狀不規則等一系列非正常狀態。當離體培養時間較短時，花粉未完全萌發，此時的萌發率與真實萌發率相比較低。當離體培養時間較長時，花粉雖已完全萌發，花粉萌發率接近真實萌發率，但此時由于花粉管長度過長影響了觀察效果，反而會增加統計難度，同樣不適合作為最佳觀察時間。因此，離體培養8 h就可以鏡檢觀察花粉萌發情況，這與秦瑤等[1]的研究結果一致。此時的花粉生活力接近自然條件下的生活力，能夠為雜交育種提供理論依據。在-80 ℃貯藏條件下，花粉萌發率在12 d中基本保持不變，主要是因為花粉在超低溫貯藏條件下，花粉呼吸減弱，消耗的營養物質較少，能夠保持較高的生活力[14]，李澤迪[15]的研究結果表明：超低溫保存技術是花粉進行長期保存的有效方式?；ǚ凵盍ο陆底羁焓窃?0 ℃條件下，施江等[16]認為，溫度過高會導致花粉脫水死亡，同時高溫度增強了花粉內部呼吸強度，從而消耗過多的營養物質，最終導致花粉生活力快速下降，不適合貯藏。比較這5種貯藏條件可以看出：花粉生活力都呈下降趨勢，原因可能是花粉在貯藏的過程中，隨著時間的延長花粉細胞內物質消耗過多，酶活性下降，水分嚴重缺乏。同時，花粉含水量的高低也會直接影響到花粉的活力，含水量高的花粉呼吸作用旺盛，細胞內的營養物質會被很快消耗，花粉生活力快速下降，而含水量適宜的花粉代謝緩慢，減少了營養物質的消耗，并能在這種條件下長期保持生活力。在花粉貯藏過程中溫度和濕度是影響花粉生活力的2個重要的環境因素，想要使花粉長期保持生活力需對花粉進行低溫和干燥處理?；ǚ墼诘蜏鼗蛘叱蜏貤l件下貯藏時，低溫條件會影響花粉內部的呼吸作用和代謝過程從而導致花粉內酶的活性隨著貯藏時間的推移而發生相應的生理生化反應[17，18]，各種代謝過程減慢，從而延長了花粉的貯藏壽命。當溫度過高或過低時，對花粉生活力都會產生不利的影響[17]。